RT2 Profiler PCR Arrays新手小技巧及注意事项
凯杰
以下是做了几百次PCR Array的Matt Finley博士的经验之谈:
RNA纯化和分析:
起始RNA样品的质量是成功实验的最重要的因素之一。我强烈推荐使用QIAGEN的RNA纯化试剂盒来进行RNA纯化。
RNA样品必须进行柱上DNase处理,以保证你的RNA的纯度。假如你的样品很特别,需要选择一个最合适的试剂盒进行纯化,请致电或e-mail联系QIAGEN技术人员,他们很乐意帮您选择一个合适的试剂盒。
确保RNA样品适合进行PCR array。RNA样品进行PCR array实验前必须先通过吸光值的测定来检验RNA的浓度和纯度,并通过凝胶电泳或者微流体、毛细管电泳等方法进行RNA完整度的测定。对于浓度和纯度,吸光度260/280和260/230的比值必须>1.8,浓度>100 ng/ul。
对于RNA完整性的分析,如果用凝胶电泳分析,28S/18S比值必须>1.5;如果借助微流体、毛细管电泳仪分析,RIN值(Agilent bioanalyzer测定的RNA完整度)或RIS值(QIAGEN QIAxcel测定的RNA完整度)必须大于7。
假如对您的RNA样品质量还有疑惑,请将这些质控数据发送给QIAGEN技术人员,我们会帮您分析您的RNA样品是否适合进行PCR array。
cDNA合成:
我推荐以1 ug的总RNA为模板,用RT2 First Strand Kit (Cat # 330401)试剂盒进行cDNA合成。根据我们的经验这是最佳的起始反应用量。
假如RNA量不够,起始总RNA样品量最少可以减至400 ng,不过必须保证RNA的质量足够好;假如连400 ng的RNA样品都无法保证,请联系QIAGEN技术人员,您可能需要进行预扩增。请使用相同起始量的RNA进行cDNA合成及后继实验,以保证各组实验结果间的可比性。
进行PCR Array实验:
关键:加完样后,将PCR板以1000 X g离心2-3分钟。
请严格按照PCR array用户手册设置PCR程序。我们针对不同类型的荧光定量PCR仪,程序进行了各自不同的优化,所以不同类型仪器的程序请勿混用。
程序运行结束后,基线可使用自动设置,但阈值必须手动设置。实验中所有需要数据相互比较的PCR array阈值必须设置成相同的数值,这样数据间才有可比性。具体的阈值设置点可根据实际实验结果调整,我们推荐设置在扩增曲线的下1/3处,使得PPC孔(标准96孔板式在H10-H12)的Ct值在17-19左右。
数据分析:
为了更好的了解我们的免费在线数据分析工具,您可以先看一下我们的相关在线技术讲座。
数据分析前请确认两点:每个PCR array实验使用的初始RNA量是相同的;读取Ct值时每个PCR Array的阈值设置都是相同的。
您的数据必须使用老版本Excel格式(即文件扩增名是.xls),我们的软件才能识别。如果您用了一次检测4个样品的384孔板,请参见最后的注释。
正确选择您的PCR Array货号。如果您使用的是2012年5月以后的产品,产品货号后面会有个“Z”,您在分析的时候也必须选择带有“Z”的货号。货号的形式是“PAXX‐###Z”。PCR array板的包装纸醒目位置标有您的PCR array货号。“Z”字母后面的数字和字母与您的PCR仪器有关,不影响数据分析。
3个RTC孔Ct值之间的差值必须小于1;3个PPC孔也是如此。
基因组DNA污染检测孔(GDC)的Ct值必须大于35,或者无检测信号。假如小于35,请确认柱上DNA消化步骤进行是否完全。RTC与PPC孔Ct的差值必须小于5。
分析软件会自动寻找最佳的看家基因进行标准化数据。我们会尽量选择各组实验中Ct值相差在1以内的作为看家基因。