使用免疫学方法检测sia α 2-3糖链

互联网2012-08-07

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1 前言

唾液酸主要存在于高等动物的细胞表面，是糖蛋白、糖脂等复合糖的组成成分，担任重要的生物学功能1）。另外，众所周知唾液酸糖链是流感病毒的受体，它像病原性微生物一样被人体识别。

传统方法检测α 2-3结合型唾液酸糖链的非还原糖链末端通常使用MAM或者MAH凝集素。这里的凝集素末端具有Sia α 2-3 Gal β 1- 4GlcNAc 结构，能与N结合型糖链的3链、4链紧密结合2）。

但凝集素对糖脂反应性低，对单糖、二糖的结合性低，且难以广泛的检测与不同苷元结合成各种类型的α 2-3结合型唾液酸。为了分析与唾液酸糖链相关的生物学、病理学功能，期待能开发出特异性检测α 2-3结合型唾液酸的探针，并克服以上缺点。

本研究室一直从事于流感病毒受体相关的研究。在流感病毒的表面，切断与宿主细胞膜上受体的结合，或者通过膜融合侵入细胞内切断相关的血凝素（HA）唾液酸从而破坏受体，与由宿主细胞而来的病毒粒子游离相关的两种神经氨酸苷酶（NA）的糖蛋白会如同穗状一样突出。

宿主细胞膜上只有存在特定的唾液酸糖链，流感病毒的HA才能结合并感染宿主细胞3-4）。众所周知人流感病毒对α 2-6结合型糖链有高亲和性，鸡禽流感病毒对α 2-3结合型唾液酸糖链有高亲和性5-7）。

能选择性识别这个特征性的唾液酸糖链结构的探针，不仅能够分析流感病毒受体的组织分布，也很可能用于分析受体的分子生物学性质和功能。

之后我们尝试研发识别α 2-3结合型唾液酸糖链的单抗。结果成功研制出产α 2-3结合型唾液酸糖链单抗的杂交瘤细胞克隆体1H/3H11/B4（以下简称HYB4）。本文阐述了我们成功建立的HYB4单抗的性质和糖链识别性及使用HYB4抗体的免疫检测法。

2 建立HYB4抗体及其性质、糖链识别性

设计HYB4抗体克隆体的步骤请看表1。用酸处理免疫原的糖脂IV3NeuAcnLc4Cer (NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc β1-3Galβ1-4Glcβ1-1'Cer)后，以Salmonela minnesota菌体膜分层作为佐剂，在C3H小鼠内进行免疫。

根据传统方法，对免疫后的小鼠的脾脏中制备而成的淋巴球和多发性骨髓瘤细胞株（PAI）进行融合后，在HAT培养基里培养。以IV3NeuAcnLc4Cer作抗原、通过ELISA法筛选菌群阳性孔培养上清液中的抗体产生物，结果得到抗体产量高、增殖能力好的3个杂交瘤细胞克隆体（抗体产生阳性率：0.5%）。

得到的克隆体产生的抗体全部都是IgG3（κ）。

我们用ELISA法详细验证HYB4抗体的糖链识别性。把各种糖脂在微孔板上固相化后，检测抗体的结合性。HYB4除了对免疫上使用的抗原糖链IV3NeuAcnLc4Cer、还对GM3(NeuAcα2-3Galβ1-4Glcβ1-1'Cer)有高结合性。

但是与拥有不同的唾液酸分子种类的GM3(NeuGcα2-3Galβ1-4Glc β1-1'Cer)完全不结合。由此显示，能识别HYB4抗体的唾液酸分子种类是NeuAc。此外，GM4 (NeuAcα2-3Galβ1-1'Cer)能微弱地结合。

研究本抗体与非还原糖链末端结构里有α 2-6 结合型唾液酸的IV6NeuAcn-Lc4 Cer(NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-1’Cer)和没有唾液酸的(nLc4CerGalβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-1'Cer)，发现抗体对其它糖脂没有反应（表2、表3）。

表明HYB4抗体的主要识别糖链是NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc β1-R、NeuAcα2-3Gal β1-4Glc β1-R。非还原末端NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-R的糖链结构同时存在糖脂和糖蛋白。另外，NeuAc α 2-3Galβ1-4Glcβ1-R的糖链结构是糖脂特殊结构。

综上所述，我们通过免疫印迹法分析HYB4抗体对糖蛋白的反应性，结果显示，HYB4抗体对糖蛋白、糖脂两方都有的非还原末端α 2-3结合型唾液酸糖链有反应，特别是存在于糖蛋白上的N-结合型或者O-结合型糖链的非还原末端里的NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ 1结构，本抗体对其都能反应。

而此次同时得到的由另外两个克隆体产生的抗体对糖链识别性和2Y/2E1/D4与HYB4抗体类似，有广泛的糖链识别性的NeuAcα2-3Gal-R、1 H/ 2 E 9 /D 2对IV 3 NeuAcnLc4Cer 糖脂有特异性。但此结论仍需进行详细分析。

表3、糖脂的名称和结构

3. 使用HYB4抗体进行免疫学检测

为了评价HYB4抗体能否用于α 2-3结合型唾液酸糖链检测，首先要确立使用本抗体的检测方法。

自从有报道阐明流感病毒能够感染人肺癌上皮细胞源的A549细胞株后，这个细胞株就被广泛用于流感病毒研究里8）。因此我们假设A549细胞表面上有结合流感病毒的α 2-3结合型唾液酸糖链存在。然后用各种免疫学方法分析A549细胞里存在的α 2-3结合型唾液酸糖链，最终确立了使用HYB4抗体的TLC-免疫染色、免疫印迹、流式细胞仪、ELISA、细胞染色法（表4）。

本抗体的实验图谱请参看图1和图2。通过TLC-免疫染色分析糖脂糖链结合性。TLC微孔板上加入等量的IV3NeuAcnLc4Cer和IV6 NeuAcnLc4Cer并洗涤后，根据传统方法检测HYB4的结合性。本抗体在微孔板上只结合IV3NeuAcnLc4Cer，不结合IV6 NeuAcnLc4Cer（图1）。

用聚-L-赖氨酸涂层盖玻片后，培养A549细胞。A549细胞与HYB4抗体在4℃反应后，固定细胞，封闭，进行FITC标签二抗反应。DAPI核染色后，用共聚焦激光扫描显微镜观察。细胞染色的结果显示HYB4抗体主要结合与细胞膜结合（图2）。

图1、使用HYB4 抗体检测含有α 2-3 结合型唾液酸的糖脂

使用TLC 免疫染色法分析抗体对糖脂的结合性。

Plate A：地衣酚显色

Plate B：HYB4 抗体的免疫染色

Line 1：IV3NeuAcnLc4Cer

Line 2：IV6NeuAcnLc4Cer

洗涤液：

CHCl3/CH3OH/12 mM MgCl2（50：40：10，by vol.）

图2、使用了HYB4的A549 细胞染色

使用了HYB4 的Sia α 2-3 糖链检测，二抗使用FITC标识的抗小鼠IgG（绿色）。

并进行DAPI核染色（蓝色）。

4 结语

唾液酸是糖蛋白、糖脂等复合糖的组成成分，与各种生物体功能相关。唾液酸含有的糖链是流感病毒的病毒受体，禽流感病毒对α 2-3结合型唾液酸糖链有高亲和性。本次我们建立的HYB4抗体是不论哪个苷元1都能特异性识别非还原末端α 2-3结合型唾液酸糖链的单抗。与现在常规用于检测α 2-3结合型唾液酸糖链的检测探针MAM\MAH等的凝集素相比，本抗体作为一种可检测多种α 2-3结合型唾液酸糖链的检测探针是十分有用的。今后期待此抗体使用在免疫学方法上，能分析生物体内唾液酸糖链分子的更多生物学、病理学功能。

指糖（链）结合了的物质的结构中，除了糖（链）意外的部分。糖蛋白里指除了N-结合型或O-结合型糖链的肽部分，糖脂里指除了糖链外的神经酰胺等脂质部分。

〔参考文献〕

1) Kamerling,J. P.,Boons,G.-J.,Lee,Y.C.,Suzuki, A.,Taniguchi, N.and Voragen, A. G. J., Editors:“Comprehensive Glycoscience FromChemistry to Systems Biology vols.1-4”,Elsevier,Oxford(2007).

2) Knibbs,R.N.,Goldstein,I.J.,Ratcliff e,R.M.and Shibuya,N.:J.Biol.Chem.,266,83-88(1991).

3) Paulson,J.C.and Rogers,G.N.:MethodsEnzymol.,138,162-168(1987).

4) Suzuki,Y.,Nagao,Y.,Kato,H.,Matsumoto,M.,Nerome,K.,Nakajima,K.and Nobusawa,E.:J. Biol.Chem.,261,17057- 17061(1986).

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