琼脂糖凝胶电泳检测DNA

目的： 学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测质粒DNA的构型、分子量的大小。

原理： 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，可作为电泳支持物，适用于分离大小范围在0.2-50kb的DNA片段。DNA分子的迁移率与分子量的对数值成反比关系。观察其迁移距离，与标准DNA片段进行对照，就可获知该样品分子量大小。在质粒抽提过程中，由于各种因素的影响，使质粒DNA呈现超螺旋的共价闭合环状、开环状分子、线状分子三种不同的构型，这三种分子有不同的迁移率。在一般情况下，超螺旋型迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的为开环状分子。用荧光染料溴化乙锭（ethidium bromide, EB ）进行检测，溴化乙锭嵌入碱基对之间形成荧光络合物，在紫外线激发下发出红色荧光。

仪器与主要试剂：

仪器：

1) 电泳仪

2) 水平电泳槽

3) 紫外检测仪

主要试剂：

1) 提取的质粒DNA

2) 5×TBE：54gTris; 27.5g硼酸; EDTA (0.5mol/l, pH 8.0) 20ml, 加水至1l，用前稀释10倍

3) 溴化乙锭（EB）：10mg/ml溶液

4) 溴酚蓝

实验方法：

1) 称取1g琼脂糖于100ml 0.5×TBE中，加热溶解，冷却至65℃左右再加入终浓度为0.5%-1.0%的EB。

2) 电泳胶模两端用透明胶带封固，梳子至于适当位置，将冷却至65℃左右的琼脂糖溶液慢慢倒在胶模上，厚度约3㎜。静置，待胶凝固后揭去胶模两端的透明胶带，放入电泳槽内，倒入适量电泳缓冲液（一般液面高出凝胶1㎝），小心拔出梳子。

3) 将5μg提取的质粒DNA样品，与等体积溴酚蓝指示剂混匀，加入凝胶点样孔内，防止产生气泡和样品溢出。

4) 将电泳槽通电，80V恒压电泳30分钟。

5) 电泳完毕，关掉电泳仪，倒去电泳槽中的电泳缓冲液，小心取出凝胶置于紫外灯下观察结果，质粒DNA条带发出红色荧光。

注意事项：

1) 防止紫外线对人皮肤及眼睛的损伤，避免直接照射皮肤与眼睛。

2) EB是强诱变剂，有致癌性，操作时要带手套，防止污染。所有含有EB的溶液在弃置前应当进行净化处理。