测序过程常见问题分析与解答

DNA测序样品用什么溶液溶解比较好？

答：溶解DNA测序样品时，用灭菌蒸馏水溶解最好。DNA的测序反应也是Taq酶的聚合反应，需要一个最佳的酶反应条件。如果DNA用缓冲液溶解后，在进行了测序反应时，DNA溶液中的缓冲液组份会影响测序反应的体系条件，造成Taq酶的聚合性能下降。

有很多客户在溶解DNA测序样品时使用TE Buffer。的确，TE Buffer能增加DNA样品保存期间的稳定性，但TE Buffer对DNA测序反应有影响，根据我们的经验，我们还是推荐使用灭菌蒸馏水来溶解DNA测序样品。

提供DNA测序样品时，提供何种形态的比较好？

答：我们推荐客户提供菌体，由我们来提取质粒，这样DNA样品比较稳定。如果您要以提供DNA样品，我们也很欢迎，但一定要注意样品纯度和数量。提供的测序样品为PCR产物时，特别需要注意DNA的纯度和数量。PCR产物应该进行切胶回收，否则无法得到良好的测序效果。有关DNA测序样品的详细情况请严格参照“测序模板的要求”部分的说明。

提供的测序样品为菌体时，以什么形态提供为好？

答：一般菌体的形态有：平板培养菌、穿刺培养菌，甘油保存菌或新鲜菌液等。我们提倡寄送穿刺培养菌或新鲜菌液。平板培养菌运送特别不方便，我们收到的一些平板培养菌的培养皿在运送过程中常常已经破碎，面目全非，需要用户重新寄样。

这样既误时间，又浪费客户的样品。一旦是客户非常重要的样品时，其后果更不可设想。而甘油保存菌则容易污染。制作穿刺菌时，可在1.5ml的Tube管中加入琼脂培养基，把菌体用牙签穿刺于琼脂培养基（固体）中，37℃培养一个晚上后便可使用。穿刺培养菌在4℃下可保存数个月，并且不容易污染，便于运送。

与测序引物有关的问题

答：对于通用测序引物，只要正确使用，一般不会有太大问题，测序引物问题主要发生在客户自己提供的PCR引物上。应该明确的一点是并不是所用的用于PCR的引物都可以用来作测序，以下几种PCR引物将是不适合用作测序引物的：

（1）简并引物，简并引物必然要在测序模板上有多个结合位点，直接影响测序结果。

（2）随机引物，如RAPD引物，随机引物一般都比较短，所用退火温度低，在测序反应的条件下，不能很好地与模板结合。

（3）过长的引物，一般要求测序引物不大于24bp，最长不能超过30bp。过长的引物在测序反应的较低的条件下容易在测序模板上有多个结合位点，导致测序结果背景增高。另外，较长的引物纯度也将难以保证。通常用于测序的引物纯度要在90%以上，引物纯度低时，测序反应的背景将明显增大，直接影响到测序结果。

（4）有特殊标记的引物，该情况主要指荧光标记的引物。我们测序反应的四种碱基都是荧光标记的，这样，荧光标记的引物将产生干扰。另外，其他一些有大的标记基团的引物也最好不要用于测序。引物上大的标记基团将直接影响到DNA 片段的迁移率，导致测序结果峰型不好或错误。

（5）不纯的引物，测序引物对纯度的要求很高，合成的引物中非全长的片段可以造成较强的背景。以一个20bp的测序引物为例， 直接脱盐纯化的话，纯度至多在70%左右，也就是说将有30%的引物将作为背景噪音，这必将严重影响测序结果。一般经PAGE或OPC法纯化的引物基本能达到测序的要求。

怎样选择（设计）测序用引物？

答：测序用引物要求非常严格，不同于PCR用引物。PCR用引物一般只要能和模板结合，3’端的几个碱基能完全配对，即使引物长达80～100多个碱基，只要调整PCR反应条件，也能成功进行PCR反应。 而测序用引物便不一样了，必须严格符合以下要求。本公司的测序用引物全用引物设计软件Primer设计。在本公司测序时，我们可免费帮助设计测序用引物。

（1）长度在15～25个碱基左右，一般选择20个碱基（根据GC含量作适当调整）。

（2）3’端尽量选择G或C碱基（但不绝对），以增加与模板的结合能力。

（3）Tm温度应选择50℃～70℃左右。

（4）GC含量应选择在50%左右，尽量避开A、T、G、C的连续结构。

（5）避开引物自身形成发夹结构或引物二聚体结构等复杂结构。

（6）保证引物和模板100%匹配，特别是3’端的几个碱基一定要100%匹配。同时必须严格保证引物和模板之间只能有一个结合位点。

PCR片段直接测序和PCR片段经克隆后测序的结果有何区别？

答：众所周知，PCR圹增过程中会出现很多错配现象，但不可能所有的错配都发生在同一位置。PCR片段直接测序时，其结果是PCR片段众多分子的混合物的结果。如果在某一个点上出现了几十次错配现象，但大多数分子（或许是几十万个分子）在这个点上应该还是正确的，在测序时，错配现象也就是反映不出来了。因此，PCR片段直接测序的结果反映的是PCR用模板最原始的结果。而PCR片段经克隆后测序是测定了某一个分子的DNA序列。在几十个循环的PCR扩增过程中，很难保证某一个分子的任何点都不发生错配。因此，PCR片段经克隆后的测序结果，往往存在着一些错配的序列，和PCR片段直接测序的结果相比有些碱基会有所不同。这种错配现象的多少取决于PCR扩增时使用的DNA聚合酶的保真性能。要减少PCR扩增过程中的错配现象，在PCR反应时，请选用保真性能高的DNA聚合酶。

我的基因序列与标准序列为什么有差别？

答：一段基因序列经扩增后，克隆到载体中进行测序。在两个层次上可能导致序列发生变化。首先在PCR扩增过程中就可能产生错误。将片段克隆到载体中也有可能发生突变。其次，测序的准确率问题。ABI公司承诺其仪器的测序精度在一定范围内可以达到98.5%以上。由于仪器准确率的限制，在一个较长的序列中发生碱基序列错误是难以避免的。在确认克隆无误的情况下，通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。您如果想得到您的最准确的序列，进行双向测序是很有必要的。只进行简单的单向测序，我们无法保证所测序列的完全准确性，这是由仪器的精度决定的。

过短的PCR产物为什么不适于直接测序？

答：首先过短的PCR产物纯化困难，一般的PCR产物纯化试剂盒都要求PCR产物片段大于150bp，过短的PCR产物纯化和准确定量都非常困难。因此我们要求用于测序的PCR产物一般不低于150bp长度。其次，由于测序技术本身的限制，测序反应对环境的干扰比较敏感，模板太短的PCR测序受外界的干扰更大，很容易造成测序失败。

用测序的方法检测点突变可靠吗？

答：有的客户想用测序的方法检测点突变体，我们认为该方法可靠性不高。主要有以下两个原因。首先，我们并不清楚突变的序列与正常的序列的比例是多少。测序反应的信号强度直接与模板的量有关，如果突变的模板所占的比例很少，将直接作为背景噪音了，很难检测出来。只有当测序反应体系中正常的和突变的模板量比较接近时，才能较可靠地检测到突变体的存在。其次，在同一位置，不同碱基的信号强度一般是不一样的。这样即使突变的模板所占的比较较高时，也不一定能准确检测到突变的存在。另外，测序仪是设计用来测序正常的碱基序列的，软件在对扫描的结果进行处理时，会尽量提高主峰而将背景信号尽量压低，以得到尽可能好的结果。因此，当某处出现双峰时，测序仪一般会认为信号弱的峰为背景信号，在处理过程中，将弱的峰进一步压低，这样根部不立于突变体的检测。因此认为，用测序的方法检测突变体的存在不是一个好的方法。