荧光定量PCR详细流程和问题解析(三)
丁香园
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一、引物设计中的几个注意事项
1、 引物设计最好用相关的软件来进行设计,考虑引物自身回折、错配、引物二聚体、复性温度、产物变性温度等问题,其中产物的变性温度是大家不太关心的问题,但有些产物在一般的95度条件下不能充分解链,会严重影响实验结果。
2、 引物所设计的片断一定要有足够的特异性,选择好片段后,最好到互联网中进行相关的搜索,看在样本的基因组有没有相拟的基因以及假基因等,如果有,则可选择特异性更高的区域。
3、 在进行mRNA表达量的定量,可以在引物设计时考虑基因组的污染问题,即在引物设计时让两个引物跨一个内含子,这样基因组污染所造成的扩增可以区别出来,或因为片段过大而不能扩增
4、 由于mRNA表达量的定量有一个逆转录的过程,如果逆转录是用poly(T)作引物,则设计的片段尽量靠近poly(A),以免逆转录的效率影响到实验结果。如果用特异性引物进行逆转录,则要考虑引物区是否存在RNA二级结构的问题
5、 产物片段的大小:定量PCR一般产生片段都不大,不会超过600bp。Sybr Green法一般选择250-600bp,过大会影响到PCR扩增的效率,过小则很难通过融解曲线与引物二聚体分开,但并不是绝对的。Taqman法的扩增片段都很小,几十或是100多,这是其原理造成的。Molecular beacon法对片段大小的要求不高,只要不是太长即可。
二、Sybr Green法的实验策略
实验可分为三个阶段,即实验条件的优化、预实验和正式实验。
1、 实验条件的优化阶段,这一阶段是最花时间的,
(1)、 要找到一个阳性的模板,可以是克隆有基因质粒、强阳性样本或纯化的PCR产物等。有了阳性的模板才能进行最基本的定量扩增实验,如果有普通PCR的实验条件,也可以此为基础进行实验。
(2)、 扩增出的产物要通过电泳方法确定其大小,以确认定量PCR扩增的产物是你的目的基因,有些用户就发生过优化了几天的条件才发现扩增片段的大小不对,不是自己想要的基因。当然,能测个序什么的最好。并通过融解曲线实验来确定产生的Tm值以及所用的变性温度是否已经足够,个别情况下会出来解键不充分的现象。
(3)、 有了基本的PCR条件后,要将阳性模板进行倍比稀释,一般用10倍稀释。将稀释的模板带上阴性对照,分成多份进行温度梯度实验,对复性温度进行优化,以找出复性温度范围。
复性温度最好能满足以下条件:高中低模板浓度下PCR扩增效率都很高、阴性模板没有扩增。选择满足条件的中间温度,这样可以提高实验的稳定性,不会因为样本管在加热模块中的位置不同而影响实验结果。
(4)、 如果找不到合适的条件,如引物二聚体过多,可对引物浓度、Mg2+离子浓度、DMSO含量等进行优化,然后再进行复性温度梯度实验。其中Mg2+离子浓度、DMSO含量都会影响Tm值以及所用的变性温度。
未完待续。