【交流】质粒大抽心得

最近做大抽，用的是Qiagen Maxi kit, 一开始抽提产量少，因为是公认的昂贵而好用的试剂盒，觉得是自己操作的不好。就仔细研究了说明书，及整个提取过程，得出一些经验。（high copy plasmid）

1.摇菌：菌摇得好不好十分重要。整个过程，其他步骤完全按试剂盒说明操作，一般没有问题，唯独摇菌得自己操作。

a.个人觉得还是先活化摇菌8h，在稀释后扩大培养较好，不要偷懒。

b.摇菌量问题：试剂盒有推荐cultrue volume，我的推荐100ml，对此我反复思索后，才明白原因：我用的柱子质粒DNA最大吸附量为500ug ，而一般培养1ml菌液可得5ug质粒，因此推荐摇菌量为100ml 。

我们知道摇菌量太多或者太少，都会影响结果，菌量太少，发现加P3后，离心，沉淀物仍漂起，有的黏附在管壁上，上清一点都不澄清。

原因是，菌量太少，以至于碱裂解后，SDS缺乏菌体蛋白和DNA 缠绕，只形成盐沉吸，故而无法离心下去。菌量太多，碱裂解不足，影响结果。

那么，到底多少比较合适呢？我按推荐量操作，出现菌量太少的情况。于是我培养到200ml ，这个量不会造成碱裂解不足。而且可以得到双倍产量。

c.抗生素，Amp较Kana 难控制，摇菌时间太长，浓度会下降很快。用的时候，加入量太多，又抑制细菌繁殖，菌量少。所以用Amp得时候，最好摸索一下最佳使用浓度和摇菌时间。

2 离心转速：说明书有时说的20000g或者15000g，有些实验室离心机达不到转速的，稍微低一点，不如12000g ，没有什么关系，或者7500g，时间延长也可以的，不必过于刻板。

3. 异丙醇沉淀：我们实验室老师们都改用无水乙醇沉淀，认为沉淀更可见。我用异丙醇，沉淀照样很明显，也不是特别松散，还是清晰可见的，如果要保险一点儿，可以离心前在管子上做好标记，这样就知道离心后沉淀的位置了。只是要特别注意，去上清时，千万不要把沉淀给倒了，不然就全白费了，money+time+energy!!!

一次得双倍产量的做法：理论上 100ml 菌 ----- 500ug plasmid DNA

200ml ------- 1000ug plasmid DNA 。

由于柱最大容量为500ug ，我们只需重新吸附+洗脱一次即可。具体做法：

1，200ml 菌量。第一遍按常规操作，但是要分别收集过柱吸附后的液体，记为A 液；收集两次漂洗后液体，记为B液（因为要做两次，这次漂洗液可以适量减少点，省下来，用于二次:D）其余继续作，得到沉淀，完成后，自此我们获得大概500ug DNA 。

千万不要扔掉A、B 液，因为里面还有大概500ug DNA

2.将A 液倒入柱子（不需要换柱子，还是用刚才用过那个），此过程即重新吸附，弃过柱液，倒入B液，相当于吸附+漂洗了，当然现在可弃过柱液了，再加入适量漂洗液（就加第一次省下的量即可），加入洗脱液，按步骤继续，又能得到500ug 左右DNA

我计算用的试剂液量，也就洗脱液多用5ml，其余跟一次大抽用量一样，这样有不浪费试剂，又可以得到双倍产量，本人得到1200ug ，分光光度计检验260、280等，两次基本相同。这样做并不影响第二次得到的plasmid DNA质量

最后，以上为个人经验，仅供参考，一定要熟读试剂盒说明书，理解抽提过程每一步含义后，方可灵活应用，建议初学者还是严格按照说明书步骤:)