离心技术与离心机类型

最大速度方法

(1)移动界面超速离心法

含几个组分的样品在足够高的离心场中离心时，每种颗粒都达到其最大沉降速度，这时样品开始分离。离心管的上层逐渐形成透明的上清液，并形成对应于样品各组分的一系列浓度界面，界面的移动相对于每种组分来说是特征的。

虽然利用这种方法不一定能实现组分的纯化分离，但可以通过监测界面的移动来测定各组分的沉降速度。要想实现组分间的分离，必须在所需样品沉降之后停止离心过程。

沉积的样品再悬浮到新的溶剂中，并以较低的速度离心使大颗粒的污染物沉降，而被纯化的样品留在溶液中，经过反复多次地离心才能得到纯的样品，这种方法就叫差示沉降离心法，它对细胞组分间的分离非常有用。也可以通过逐渐增大转速的方法实现不同组分间的分离，如图1。

图1 细胞匀浆差示分离的示意图

(a)细胞匀浆；(b)细胞碎片；(c)线粒体、过氧化物酶体、溶酶体；(d)微粒体、核糖体；(e)细胞液；(可溶性蛋白质及小分子生物)

(2)移动区带超速离心法

差示离心法离心前各组分均匀分布在整个溶液中，所以分离一般不理想，而移动区带超速离心法是一种密度梯度(Dens 心Gradient)离心技术，在离心之前离心管中溶液的密度不同(从上到下密度增大)。

梯度介质中最大密度应小于样品物质的最小密度，其特点是物质的分离取决于样品物质颗粒的质量．即样品物质的沉降系数，而不是取决于样品物质的密度，因而适合于分离密度相近而大小和形状不同的物质，这属于一种非平衡态分离法。

当样品物质轻轻地铺在密度梯度介质的液面上，起动离心机，在离心力的作用下，一定时间后便形成不同物质的区带。当继续离心时每个区带会逐一达到管底，所以，在沉降最快的区带到达管底之前要停止离心，并将每个区带分部收集。最常用的制备密度梯度的化合物有蔗糖、甘油、氯化铯和硫酸铯等。

等密度方法

等密度离心法也叫沉降平衡法。所谓等密度是指样品密度与介质的密度相等，实际上是在梯度密度介质中进行的。该技术的特点是沉降分离与样品物质的大小和形状无关，而取决于样品物质的密度。

这种方法非常类似于电泳中的PH 梯度等电聚焦方法，在离心时，颗粒依其密度的不同沉降或向上漂浮，直到移动到与自身的密度相同的溶剂梯度中为止，其结果是依样品物质密度的不同在梯度溶剂中形成一个个区带。

在实验方法上可以采用预先制备密度梯度溶液的方法，一般先制备两种储备液，它们的浓度决定最终所形成梯度溶液的极限。

可以通过分步减小密度，从离心管底部到上部逐渐加液的方式形成不连续梯度溶液，也可以通过一个梯度混合器产生连续梯度密度。储备液一般使用两种密度的蔗糖溶液或两种密度的氯化铯溶液来制备。样品一般铺在溶液的表面，然后开始离心。

在实验方法上也可以采用平衡密度梯度法，在这种离心法中，介质的梯度不是预先配制，而是在离心过程中，由于离心力的作用而逐渐形成。样品物质和氯化铯的浓盐溶液充分混合均匀，离心开始之后，铯盐由于离心力的作用，自离心管口至离心管底形成连续递增的密度梯度。

生物样品中不同组分物质在离心过程中沉降或上浮以寻找与自身密度相同的溶液密度梯度区带，不同的物质最终到达相应的区带，从而实现分离。这种方法依赖于在离心场的作用下低分子量的铯盐密度梯度的形成，一般需要长时间的离心(2~3天)。

显然，样品物质的密度应介于介质梯度中最大和最小密度之间，否则，样品将沉到离心管的底部或漂浮到溶液的顶层。

无论是采用哪种操作方式，最终都要分别收集处在每一区带的样品组分，一般可采用下述两种方法实现：

(1)穿刺法

这是方便而又理想的部分收集方法。用一根金属空心针从离心管底刺人管内，不同区带内的组分自下而上地先后从针管内分别流出，然后用部分收集器分别收集。

(2)取代法

在离心管口加一个带有收集导管的塞子，塞子上同时装有一根输液导管插入离心管的管底，从输液管中注入高密度的离心介质．其密度高于离心管中所形成的最大密度。当取代液不断注入时离心管中的溶液逐渐上升，并不断从收集导管中流出，然后用部分收集器分别收集。