脂肪氧化酶活性测定

各位同学，本人前些日子做了脂肪氧化酶活性测定的工作，遇到了一些问题，想在这里向大家请教，希望大家能不吝赐教，来帮助我解脱心中的迷惑。

本人是做植物材料的，从叶片中提取粗蛋白，0.5g叶片使用液氮研磨，加入到4ml冰预冷提取缓冲液（0.05mol/L PH6.4 磷酸钠缓冲液，1mmol/L EDTA，1%PVP，1mmol/LDTT）中，12，000g，4℃离心10min，取上清进行脂肪氧化酶酶活性分析。

通过检测234nm光吸收（Beckman DU800, Beckman）来测定脂肪氧化酶活性，底物溶液配制：280mg亚油酸，280mgTween-20加入到8mL双蒸水中，上下颠倒混匀，加入1mL 1mol/L NaOH使溶液澄清加双蒸水定容到50mL，-70℃保存备用(Huang, et al. 2005)。

2mL反应体系包括：1.93mL 0.1mol/L pH6.4 磷酸钠缓冲液，50μL底物溶液，20μL酶粗提液，同时设立不加酶的空白对照，25℃反应3min，记录234nm光吸收变化。

实验方法就是上面所说的，但是遇到了几个问题。

1.在不加入粗蛋白的情况下，234nm光吸收持续上升，我觉得可能是亚油酸在空气中氧化造成的，我又无力避免。

2.采用不同PH的缓冲液，不加粗蛋白的情况下，234nm光吸收上升的速率不同，PH越高234nm光吸收上升速率就越缓慢。

3.在加入粗蛋白后，234nm光吸收不升反降，在3分钟后才又上升。

这样一来我测酶活反应基本不可能，我觉得可能是我测酶活的反应体系出了问题，在测原核表达后的酶活性该体系还马马虎虎，在PH6.4时的确还是转化的大肠杆菌的粗蛋白脂肪氧化酶活性高些，但是从叶片中提取的粗蛋白就不能测出来酶活性了。

在后续的实验我还想做酶反应后的产物的HPLC分析，如此强的本底反应让我不知道还要不要做下去，我的方法是克隆一篇文献的方法，这里我不是怀疑人家工作的真实性，我想可能还是我愚钝。

[1] Huang YF, Lan WZ, Chen C, Yu LJ (2005) The role of lipoxygenase in elicitor-induced taxol production in Taxus chinensis cell cultures. Process Biochemistry 40:2793–2797

各位兄台，給我出出主意吧，基因克隆出来，原核表达也还不错，整个实验卡在最后，虽然原核表达后有一些酶活性，但是总是觉得反应体系不是很好，试验不是很稳定，想进一步做些酶学分析，这样的体系真是不可靠。