蛋白质浓度测定——紫外吸收法
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蛋白质浓度测定——紫外吸收法
[原理]
由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质溶液在280nm处具有紫外吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶液在此波长处的吸光度与其浓度呈正比关系，因此利用这一性质可进行蛋白质定量测定。
该法迅速、简便、不消耗样品、低浓度盐类不干扰测定，可测定0.1～1.0mg/mL的蛋白质溶液。
由于蛋白质的紫外吸收高峰常因pH变化而改变，故应用此法时要注意溶液的pH。最好样品的pH与标准曲线制定时的pH一致。
本法对于测定与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质误差较大，故适用于测定与标准蛋白质酪氨酸、色氨酸这类氨基酸含量相仿的样品；若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。
例如混有核酸，核酸可吸收波长为280nm的紫外光，但它对260nm紫外光吸收更强。而蛋白质恰恰相反，280nm的紫外吸收值大于260nm紫外吸收值。运用280/260吸收差法则可以适当校正核酸对蛋白质浓度测定的干扰作用。
[方法与步骤]
1、标准曲线的制作
取7支试管，编号后按下表依次加入标准蛋白溶液和氢氧化钠溶液。
|
管号 试剂 |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
|
标准蛋白溶液/mL |
0 |
0.5 |
1.0 |
1.5 |
2.0 |
2.5 |
3.0 |
|
0.1mol/L NaOH/mL |
4.0 |
3.5 |
3.0 |
2.5 |
2.0 |
1.5 |
1.0 |
加毕，搅匀，选用石英比色皿，用紫外 分光光度计 测A280。
以每管标准蛋白毫克数为横坐标，对应的A280值为纵坐标，作标准曲线图。
2、蛋白样品测定
（1）标准曲线法
实验中样品可用牛奶中自制的酪蛋白溶液加0.1mol/L NaOH稀释而成。
把样品蛋白溶液装入石英 比色皿 中，测A280，对照标准曲线求得蛋白质浓度。
式中 n——从标准曲线上查出的酪蛋白毫克数。
（2）280nm与260nm吸收差法：
分别测定蛋白质样品在280nm、260nm处的吸收值，按下列公式计算蛋白质质量浓度。
蛋白质质量浓度（mg/ mL）=1.45 A280 - 0.74 A260
式中 A280——蛋白质溶液在280nm出测得的吸光度；
A260——蛋白质溶液在260nm出测得的吸光度。
不同蛋白质及核酸的光吸收率不完全相同，按此式计算仍可能产生误差。
