人类滑膜原代细胞培养

1、将切下的组织在手术台上请护士将标本放入低温生理盐水中（可不要动它），在手术完成时将标本放入PBS冰水液中并放入消毒的容器中带回实验室；

2、在超净台中将标本放入培养皿中，加入α-MEM洗涤；

3、获得组织切开，仔细辨认于关节反折处及增生的白色光滑的滑膜组织，附于关节软骨面的增生的血管翳也为滑膜组织（可作另一管消化），仔细剔除脂肪组织，用α-MEM洗二次（以去除红细胞），放在小青瓶中用解剖剪锐性切碎

4、用双倍获得组织的体积含有4mg/mlⅠ型胶原酶的α-MEM消化37℃孵育120分钟（在此期间震动混匀数次）；

5、30分钟后收集第一管细胞：细胞悬液经70μm细胞滤网过滤，用1500-2000转离心6分钟，上清为Ⅰ型胶原酶加入未过滤网的组织，继续用于消化；

6、离心管底细胞用α-MEM离心洗涤2次，每次用α-MEM重悬浮后用1500-2000转，离心6分钟，最后一次用记数板观察到有细胞。细胞最终悬浮于含有10%胎牛血清的α-MEM中，接种到培养瓶中培养。

7、60钟后收集第二管细胞：细胞悬液经70μm细胞滤网过滤，用1500-2000转离心6分钟；用α-MEM洗2次，每次用α-MEM重悬浮后用1500-2000转离心6分钟，最后一次用记数板观察细胞并计数。细胞最终悬浮于α-MEM含有10%胎牛血清中，接种到培养瓶中培养。

8、必要时可做第三管细胞收集；并立即作原代滑膜细胞培养。

9、每2-3天换液一次。

体会：

1、虽然国内外文献有组织块培养法获得滑膜细胞，但我试过，没有获得滑膜细胞，可能方法没掌握好或实验条件不同；

2、我探索过用0.25% trypsin或0.25% trypsin＋ 0.02%EDTA 或 collagenaseⅠ或collagenaseⅡ消化细胞或合用，只有单用collagenaseⅠ有用、最好；

3、机械法很难获得细胞；

4、全培用α-MEM或RPMI1640或DMEM，加10%胎牛血清。不能用小牛血清，胎牛血清用国产即可

5、必须用Ca－free的PBS。