MHC 四聚体应用：TCR 样抗体研发

MHC I 类分子在 CD8+细胞免疫系统中起到抗原呈递和识别作用。因其特异性，MHC-多肽复合物在免疫治疗中起着重要作用。虽然 MHC-多肽复合物能够被 TCR 特异性识别，但大多数天然 TCR 受体不仅稳定性低，与 MHC-多肽复合物的亲和力也低。

为了解决上述两个不足，以肿瘤抗原表位为靶点，制备亲和力高，且可溶性强的 TCR 样抗体成为替代野生型 TCR 受体的最佳选择。该类 TCR 样抗体作为一种新的免疫分子，起着识别并杀灭肿瘤细胞的作用。

1、以 T 细胞表位为靶标的免疫治疗

自身免疫系统紊乱时的细胞和癌症细胞都会表达一些特殊肽，这些肽段和细胞表面 MHC 分子结合。癌症病人表达特异性短肽的肿瘤细胞能够被 CTL 识别。尽管存在这种识别机制，但在肿瘤组织中，肿瘤细胞凋亡逃逸普遍存在。

近几年，随着对肿瘤相关抗原研究的逐步加深，人们也在设计和验证针对肿瘤特异性抗原的相关免疫治疗方案，并在癌症病人的特异性治疗上取得一定成绩。肿瘤细胞表达的肿瘤相关抗原研究较多，大体上可分为 3 类：

1）由蛋白突变导致的肿瘤特异性抗原，例如结肠癌的 B-catenin 突变。

2）由某些限定细胞系表达的抗原

3）来源于基因高表达或是扩增，例如 HER-2/neu

至于免疫治疗方案，大多数研究者将目光放在了如何增强对肿瘤细胞的获得性免疫。包括获得性免疫 T 细胞，癌症细胞短肽疫苗，自身性癌症疫苗，和 DC 疫苗。这些不同方法在临床上都取得了巨大进步。

基于细胞治疗的研究工作面临着诸如细胞凋亡机制等挑战，虽然这些挑战限制了 CTL 的抗肿瘤活性。但利用抗体，通过模拟的方法能够较好解决这个问题。特异性肿瘤相关 MHC I-多肽复合物起到特异性免疫调节作用。利用这个性质，可将含有特异性短肽的 MHC I—多肽复合物作为肿瘤细胞表面的特异性抗原。

此种抗原不仅可作为细胞治疗的靶向分子，还可以起到区分癌症细胞与正常细胞的作用。不仅如此，选用能够被 TCR 识别的相关性好的系列短肽，这些短肽和 MHC 形成 MHC-短肽复合物后，能够识别多数常见肿瘤。

TCR 样抗体特异性识别肿瘤细胞的机理与 MHC-短肽复合物被 T 细胞识别相同。基于细胞治疗方案，容易受到细胞本身状态等诸多因素制约。相比细胞治疗，可溶性抗体具备产量更高；肿瘤浸润能力强于 T 细胞等优点，作为治疗手段优于 T 细胞。

TCR 样抗体在免疫系统中，具备两个较大的优势：从生物学角度看，TCR 样抗体具备较好的抗原特异性。作为药物其稳定性强于 T 细胞，T 细胞受到外界影响较多。与此同时，肿瘤细胞受到肿瘤微环境影响，大多数肿瘤细胞表面 MHC 分子表达下调。基于此认识，高亲和力的 TCR 样抗体尤其适合低密度 MHC 表达抗原。

2、T 细胞受体样抗体

MHC 限制性抗原特异性 T 细胞抗体较少，也难以制备。TCR 识别与 MHC 分子结合的线性短肽。这种机制与 B 细胞识别机制不同，B 细胞识别可溶性或细胞膜抗体的三维结构，不受任何 MHC 限制。至此，T 和 B 细胞在免疫系统中展现两种不同功能的识别机制。

T 细胞识别细胞膜表面 MHC I 或 II 类分子呈递的抗原肽来识别细胞。而 B 细胞没有选择识别机制。近几年，TCR 样抗体研发工作取得较大进展，许多研究团队都具备制作该抗体能力，研发出了许多针对肿瘤和病毒 T 细胞表位的 TCR 样抗体。

能够获得被 T 细胞识别的，纯化后自然折叠 MHC-短肽复合物，是 TCR 样抗体制备关键。MHC-短肽复合物可以通过大肠杆菌表达获得。大肠杆菌分别表达 MHC 重链和β-球蛋白，在体外折叠后，与短肽亲和得到 MHC-短肽复合物。折叠后的 MHC-短肽复合物要求较高，所制备的复合物要求非常纯净，并且折叠正确。

所制备 MHC-短肽复合物经过生物素标记后，可在体外情况下筛选特异性 TCR 样抗体。许多实验室尝试获得可被 T 细胞识别的表位，但是许多实验室在制备时候出现困难。1996 年，Andersen 等证明利用噬菌体展示技术作为手段获得特异性抗体。

他们在噬菌体粒表面融合抗原蛋白后，通过展示筛选得到相应抗体。在噬菌体粒中存在不同基因，这些基因在噬菌体表面表达不同序列蛋白。经过几轮筛选和细菌培养后，洗脱得到需要的噬菌体。相比杂交瘤技术，噬菌体展示呈现出更强的正向选择性。

许多研究团队构建噬菌体肽库来筛选合适的抗体。噬菌体展示技术首先能够分离具备短肽特异性，MHC 限制性等特点的小鼠 MHC I 类抗体。此后，也制备出人类 HLA 相关疾病抗体。

3、TCR 样抗体筛选

TCR 样抗体的特异性和亲和力高低，决定该抗体好坏。具有 MHC 限制性的特异 T 细胞抗体较难制备。但是，最近几年经过许多团队的努力，利用肿瘤或病毒 T 细胞表位制备 TCR 样本抗体工作得到长足发展。

结合噬菌体展示体外筛选方法和制定合适的免疫程序，得到许多 TCR 样抗体。噬菌体展示筛选，通量高，筛选压力大。在筛选之前，可构建数量较大的基因库，将基因库导入噬菌体，能够尽可能地筛选到较理想抗体。

3.1 噬菌体展示文库

噬菌体展示技术，主要是将外源基因融合到噬菌体粒表面。每个噬菌体粒展示一个抗体。构建展示文库，通过基因手段将文库序列构建到噬菌体中。使得每个噬菌体展示独一的抗体基因。文库越大，所涵盖信息越多，通过展示技术能够获得有用抗体就越多。

3.1.1 原始文库

噬菌体展示筛选出具有亲和力的 TCR 抗体，通常不能有效地用于治疗目的。挑选出具有亲和力的的 TCR 抗体基因，做随机突变和目的性突变都能够增加 TCR 样抗体亲和力。Chames 等 （2000） 报道，针对肿瘤 T 细胞表位筛选出具有亲和力的 TCR 样本抗体后，在 Fab 做随机突变，通过体外筛选将其亲和力提高了 18 倍。

Renner 等（2003）分析 HLA-A2/NY-ESO-1 的 TCR 样 Fab 3M4E5 蛋白结构，确定一些决定亲和力高低的关键氨基酸，在关键氨基酸位点做定点突变，在没有改变 MHC 识别部位的螺旋结构情况下，将 TCR 样 Fab 亲和力提高到 20 倍。

来源于噬菌体展示的 TCR 样抗体以单价抗体形式呈现。同时，该类抗体可以在细菌中现场较高稳定性利于纯化。单价片段可用来开展例如抗原筛选和结构分析等研究。另外，单价片段可作为转载蛋白的靶标。

但是，以单价形式出现的抗体其亲和能力不强，尤其是在肿瘤低密度表位研究工作中表现尤为突出。为弥补该不足，将 Fab 或 scFV 制备成四聚体形式，将荧光分子标记于该四聚体可用来分析与 MHC-短肽复合物的亲和力。

3.1.2 免疫文库

噬菌体展示免疫文库构建，该步骤作为噬菌体展示筛选的补充。将重组 MHC-短肽复合物免疫小鼠，而后用小鼠脾细胞来构建噬菌体展示系统。是使用到的小鼠应选用自身 MHC 缺失，且稳定表达人类 HLA 基因的小鼠。用 MHC-多肽复合物免疫该类型小鼠。该类型小鼠可以增加 TCR 样抗体获得率。

4、抗体效用评价

噬菌体筛选得到系列具有亲和力的抗体 Fab 片段。由此得到亲和力 Fab 片段基因信息。将此类基因序列克隆到载体上，制备出抗体。此类抗体亲和力高低如何？还需要进一步评价。ELISA 评价抗体亲和力方法，为研究者普遍接受。

TCR 样抗体评采用 MHC-多肽复合物，包被做 ELISA 方法。Bhavna Verma 等（2010），以乳腺癌为研究模型，选择 hCGB Ag 抗原。将 Ag 抗原上的短肽 GVLPALPQV 与 HLA-A2 制备 HLA-短肽形式。免疫小鼠，得到抗体。

在评价抗体时，将 HLA-短肽复合物制备成 MHC 四聚体，并将四聚体包被于酶联板上。制备好不同备选 TCR 样抗体，测定 ELISA 数值，评价不同的候选 TCR 样抗体。

MHC 四聚体是将四个 MHC-短肽复合物交链在链霉亲和素上。将 MHC 四聚体包被在酶联板，利用 ELISA 方法测定抗体亲和力，可达到高通量检测效果。

Anna Sergeeva 等（2011）在研究人类急性髓细胞样白血病的 TCR 样抗体工作中，用 HLA-A2-PR1 多肽复合物免疫小鼠，分离小鼠脾脏细胞。培养单克隆细胞，制备抗体。将 MHC-PR1 多肽复合物包被于酶联板上，进行同量化 ELISA 筛选。在 2850 个克隆中，筛选到一个（8F4）具备亲和力的抗体。

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