差异基因研究技术及其应用

［摘要］ 差异表达基因与疾病密切相关，深入研究可在基因水平揭示疾病的发病机制，从而探索疾病治疗的有效方法。随着分子生物学技术的发展，各种研究差异表达基因的方法应运而生，尽管每种方法都有其缺陷和不足之处，但毕竟为我们提供了切实可行的研究方法，现就目前的主要研究技术做一综述。

［关键词］ 差异表达基因；差异显示PCR方法；消减杂交法

Technology on differential gene and its application

［Abstract］ Differential expression gene is related to the diseases.To study these genes deeply may contribute to expose the pathogenesis of diseases in gene level and explore the effective methods to cure the diseases.With the development of molecular biology,all kinds of technology appeared to study differential expression gene.Although its limitation,these methods provide the feasible technology to study differential expression gene.The article reviewed the major technology of differential expression gene.

［Key words］ Differential expression gene;differential display PCR;subtractive hybridization

在高等生物个体发育中，不同组织细胞在不同时期的基因表达按照时间和空间顺序有序地进行，称之为基因的差异表达；那些异常表达的基因可能直接或间接关系到疾病的发生和易感性。

筛选和鉴定这些差异表达的基因对于从基因水平揭示疾病的发生机制，探索疾病治疗的有效方法具有重要意义。现就目前研究差异表达基因的主要方法及其原理分述如下。

1 cDNA微阵列技术（cDNA microarray hybridization）

该技术是指在固相支持物上直接将大量已知序列的探针有序固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，杂交信号阳性的探针序列就是在组织或细胞中表达的DNA序列。cDNA微阵列技术具有商品化的芯片，DNA样品形成致密的微集阵列，其集成度可达2万个点阵/cm2［1］。

该技术可用于大规模筛选差异表达基因。Midorikawa等［2］为了阐明雄激素脱发患者脱发区和未受累部位毛乳头细胞基因表达谱的差异，通过该技术筛选到107个差异表达基因；其中BMP2和ephrin A3的基因表达显著下调，因此认为BMP2和ephrin A3在毛发周期中具有促进毛发生长的作用。

该技术用于疾病诊断和药物疗效评价，用于诊断是否携带艾滋病病毒［3］的基因芯片已经问世；有学者［4］应用该技术评估咪喹莫特治疗HPV2/27/57引起的生殖器疣，明确了咪喹莫特对生殖器疣的治疗作用。

尽管该技术具有良好的应用前景，但目前序列确认的人类cDNA克隆还相当缺乏，在一定程度上局限了DNA芯片技术的发展；基因芯片造价很高，目前只有大制药公司和研究所能承受，这些都限制了其应用范围。

2 基因表达系统分析（serial analysis of gene expression，SAGE）

SAGE其原理是以mRNA为模板，用生物素标记的Oligo（dT）为引物合成双链cDNA，以限制酶进行酶切，捕获cDNA 3′端；产物被分为两部分，分别与包含有标签内切酶位点的A、B连接子相接。经过酶切，就有可能得到只有9~10bp的标签序列。

每两个标签的钝端结合后成为PCR的模板，以基于A、B连接子的引物进行PCR反应的结果是得到了大量每条包含两个不同来源标签的序列，接下来再用限制酶酶切、连接，就能将多个不同的标签链接在一起，克隆至质粒载体中后集中测序。

SAGE可以检测不同细胞间已知基因表达的具体差异，系统地分析基因表达的差异。Cornelissen等［5］运用该技术，从艾滋病相关Kaposi’s肉瘤的基因表达谱获得64个表达显著上调的基因，28个表达下调的基因。

Urschitz等［6］应用该技术研究了晒伤皮肤的基因差异，明确表皮在晒伤皮肤的发病中发挥主要作用。SAGE技术的缺点在于工作量大，有大量的测序及计算机分析任务；对于寻找新基因而言，仅用长度为13bp的寡核苷酸探针筛选cDNA文库导致假阳性结果居多。

3 差异显示PCR方法（differential display PCR,DD-PCR）

利用可以扩增所有哺乳类mRNA的几条5′特定引物和几条3′锚定引物随机组合，将cDNA进行PCR扩增，这样对于相同的cDNA，PCR产物的种类多少和分布应该是完全一样的，而对于不同的cDNA则可以找到差异条带，它们所代表的cDNA就有可能与细胞状态的改变或疾病状态相关。

差异显示PCR方法具有快速、所需RNA量少、可同时显示多种生物性状的差异及可以同时获得高表达和低表达的基因等诸多优点；但假阳性率高，可高达70%的假阳性条带［7］；不能反映低拷贝mRNA的差异，对高拷贝基因有偏向性；获得的片段多为300bp左右的3′非编码区，很难判断其功能和意义，只能提供研究线索。

哺乳动物的创伤愈合常需要数周至数月时间，伴有瘢痕形成且机制不明，MRL/MPJ（MRL）鼠具有无瘢痕愈合的能力，Masinde等［8］采用差异显示PCR方法研究了参与MRL/MPJ（MRL）鼠无瘢痕创伤愈合的基因，鉴定了36个与创伤愈合有关的差异表达基因，为无瘢痕创伤愈合的研究提供了靶基因。

4 消减杂交法（SH）

经典的消减杂交法是将实验组mRNA（或cDNA）与对照组cDNA（或mRNA）杂交，去除杂交体和未杂交上的对照组成分（cDNA或mRNA），得到实验组独有的cDNA或mRNA，这些基因即为差异表达基因。为克服传统的消减杂交法的不足，新的消减杂交技术应运而生。

4.1 代表性差异分析技术（RDA） 原理是首先用DpnⅡ或Sau3AI酶切两组双链cDNA，两端接上单链接头R，补平后，用含接头R序列的引物扩增，再用DpnII或Sau3AI去除双链cDNA两端的接头R；只给予实验组双链cDNA两端再接上单链接头J。

将实验组与驱动组cDNA杂交，杂交反应体系中只有实验组自身杂交形成的双链cDNA才两端都带接头J，补平后可被含有接头J序列的引物几何级扩增，而只有一端带接头J的杂交体只能被线性扩增。将此杂交产物再进行第二轮酶切、加接头、杂交和PCR扩增，重复两次后，可确保从实验组中彻底去除与驱动组共有的序列。

其优势为：

（1）高效性，与传统的消减富集相比，更加敏感，可以筛选出低拷贝的差异基因；

（2）可靠性，结果重复性好，假阳性率非常低。Chang等［9］结合cDNA-RDA和膜杂交筛选，对比正常人口腔黏膜上皮和HPV永生化的口腔上皮细胞系，获得了384个差异表达的克隆，并证实其中含69种差异基因。

cDNA-RDA技术的局限性在于：

（1）得到的差异片段是平均为300~600bp的小片段。

（2）由于cDNA较基因组DNA短，消化后可造成cDNA序列两端信息量丢失。

（3）完全无酶切位点的片段无法参与RDA筛选。

（4）在极低拷贝差异基因的筛选上进行了改进，但仍有不足［7］。

4.2 抑制消减杂交法（SSH） SSH是抑制PCR与消减杂交技术相结合的更简单快速的分离差异基因的方法。其原理是丰度高的单链DNA在退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA，从而使原来在丰度上有差别的单链DNA相对含量达到基本一致；而抑制PCR则是利用链内退火优于链间退火的特点，使非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构，无法作为模板与引物配对从而选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。这样既利用了消减杂交技术的消减富集，又利用了抑制PCR技术进行了高效率的动力学富集［10,11］。

SSH技术形成了自身的优势：（1）提高了特异性，降低了假阳性率。（2）具高度灵敏性，克服了低丰度mRNA不易检测的问题，这个方法简单到只需一轮杂交即可分离出差异基因。（3）提高了基因克隆的效率，提高了信息量，更具代表性。（4）可同时分离上百个差异表达基因。（5）程序相对简单，操作简便，接头设计简化且不需反复交换接头。

许多学者应用该技术成功获得针对不同疾病的靶基因，Yin等［12］发现T细胞在感染HIV-1ⅢB后经历了细胞的凋亡和功能恢复，于是应用SSH技术构建了HIV-1 ⅢB感染第7天和第18天的差异基因表达谱，建立了2个消减cDNA文库，在两个时间点筛选到200个高度表达的差异基因，鉴定了特异性凋亡相关基因和其他候选兴趣基因；Northern blot分析确定了在两个时相的优势表达基因，为HIV-1感染的治疗提示了新的方式。

尽管SSH技术具备诸多优势，但其所需mRNA量达2μg，样品来源较易且新鲜，非酶切位点的突变、缺失或插入均不能有效被发现；得到的为cDNA片段尚需扩增其全长；完全无酶切位点的片段或酶切位点较少的基因组无法用SSH技术筛选。

4.3 基于PCR的消减杂交法（PCR-based subtractive hybridization） 该方法是分别将实验组和对照组的mRNA进行反转录；对于实验组，利用mRNA的3′poly A尾和5′-GGG帽结构分别在cDNA两端加上序列相同的锚定引物；对于对照组，将其cDNA进行随机引物PCR扩增制备探针，同时掺入生物素（Biotin-11-dUTP）。然后将实验组的cDNA与掺有生物素的探针进行杂交，杂交反应物用连有链亲和素的磁珠吸附掉杂交体及未杂交上的探针，得到实验组独有的cDNA，然后用锚定引物将其扩增并克隆。

该技术具有两大优势：一是杂交后未杂交上的实验组单链cDNA可直接作为模板被扩增，所以低丰度的cDNA被扩增的几率大大提高；二是可以直接获得全长cDNA，使获得功能基因的速度大大加快。Li等［13］利用该技术筛选了抗原活化的树突状细胞（DC）的差异表达基因，并成功获得了新的全长cDNA：KE04。

Meije等［14］应用该技术从黑素细胞、痣细胞和非转移黑素瘤细胞的差异表达cDNAs文库中，筛选了Ras相关蛋白Rab5b、pCMa1和pCMn2基因等12个新基因；pCMa1的表达量在转移性恶黑高于原发性恶黑；pCMn2在转移和非转移恶黑均有表达，但在正常黑素细胞和痣细胞不能检测到。Rab5b显示在高度转移恶黑的表达显著低于其他类型的恶黑，这3个cDNAs可能参与了黑素细胞的早期形成和恶性转化。

尽管这些具有代表性的方法虽然都不是很完善，不能预期通过它们得到所有的差异表达基因，但通过这些技术已经获得了大量的重要基因；随着各种差异表达基因筛选技术的不断完善，许多常规不能筛选到的低丰度差异表达基因、全长cDNA可望得以分离和鉴定。

［参考文献］
　　1 Blanchard AP, Hood L. Sequence to array: probing the genome’s secrets. Nat Biotechnol,1996,14（13）:1649.
　　2 Midorikawa T, Chikazawa T, Yoshino T, et al. Different gene expression profile observed in dermal papilla cells related to androgenic alopecia by DNA macroarray analysis. J Dermatol Sci，2004,36（1）:25-32.
　　3 Marshall A, Hodgson J. DNA chips: an array of possibilities. Nat Biotechnol,1998,16（1）:27-31.
　　4 Jacobs S, Grussendorf Conen EI, Rosener I. Molecular analysis of the effect of topical imiquimod treatment of HPV 2/27/57-induced common warts. Skin Pharmacol Physiol,2004,17（5）:258-266.
　　5 Cornelissen M, van der Kuyl AC, van den Burg R, et al. Gene expression profile of AIDS-related Kaposi’s sarcoma. BMC Cancer,2003，3（1）:7.
　　6 Urschitz J, Iobst S, Urban Z, et al. A serial analysis of gene expression in sun-damaged human skin. J Invest Dermatol，2002,119（1）:3-13.
　　7 Yuan BZ, Miller MJ, Keck CL, et al. Cloning, characterization, and chromosomal localization of a gene frequently deleted in human liver cancer（DIC21）homologous to rat RhoGAP. Cancer Res,1998,58（10）:2196-2199.
　　8 Masinde G, Li X, Baylink DJ, et al. Isolation of wound healing/regeneration genes using restrictive fragment differential display-PCR in MRL/MPJ and C57BL/6 mice. Biochem Biophys Res Commun,2005,330（1）:117-122.
　　9 Chang DD, Park NH, Denny CT, et al. Characterization of transformation related genes in oral cancer cells. Oncogene,1998,16（15）:1921-1930.
　　10 Diatchenko L, Lau YF, Campbell AP, et al. Suppression subtractive hybridization: a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries. Proc Natl Acad Sci USA，1996,93（12）:6025-6030.
　　11 Diatchenko L, Lukyanov S, Lau YF, et al. Suppression subtractive hybridization: a versatile method for identifying differentially expressed genes. Methods Enzymol，1999,303:349-380.
　　12 Yin J, Chen MF, Finkel TH. Differential gene expression during HIV-1 infection analyzed by suppression subtractive hybridization. AIDS，2004，18（4）:587-596.
　　13 Li N, Huang X, Zhao Z, et al. Identification and characterization of a novel gene KE04 differentially expressed by activated human dendritic cells. Biochem Biophys Res Commun,2000,279（2）:487-493.
　　14 Meije CB, Hakvoort TB, Swart GW, et al. Gene expression patterns in melanocytic cells: candidate markers for early stage and malignant transformation. J Pathol，2002，196（1）:51-58