核糖体rDNA ITS序列在真菌学研究中的应用

　　在真菌学研究中，传统的菌物分类以形态特征和生理生化指标为分类基础，但大部分菌物的种类多、分布广、形态特征复杂，而且少数形态特征和生理生化指标随着环境的变化而不稳定，因此，传统的菌物分类常引起分类系统的不稳定或意见分歧。

近年来随着分子生物学的发展，同时也是真菌学自身发展的客观需求，分子生物学技术在真菌学研究中得到了广泛而深入地应用。一些分类地位不明确、亲缘关系不清楚的物种通过该技术得到了验证。一些重要的病原真菌遗传信息得到阐明，并在群体遗传变异、地理生态、抗病育种等方面得到应用[1~3]。

　　目前，真菌核酸序列研究几乎都集中在rRNA基因上，因为rDNA 存在着广泛的保守区域，可以用作引物的结合位点，同时客观存在的不同区域进化水平不同，可以用于不同分类等级的研究。

用于扩增rDNA不同区域的保守引物已设计成功[4]，并广泛用于菌物系统发育研究中。本文就目前真菌基因组核糖体DNA(rDNA)的基因间隔区ITS序列在真菌学研究中的现状做一简要概述。

　　1．核糖体rDNA的结构及其特点

　　核糖体是一个致密的核糖核蛋白颗粒，执行着蛋白质合成的功能，它由几十种蛋白质和rRNA组成。编码rRNA的rDNA是基因组DNA中的中等重复、并有转录活性的基因家族 (genefamily)。rDNA一般由转录区和非转录区构成。

转录区包括5S、5.8S、18S和28SrDNA，其中18S、5.8S和28S rDNA基因组成一个转录单元，产生一个前体RNA。

内转录间隔区ITS(internal transcribed space)位于18S和5.8S rDNA(ITSl)之间以及5．8S和28SrDNA之间(ITS2)，在18S rDNA基因上游和28S rDNA基因下游还有外转录间隔区ETS(external transcribledspace)。ITS和ETS区的转录物均在rRNA成熟过程中被降解。

ITS和ETS包含有rDNA前体加工的信息，在 rRNA成熟过程中有着相当重要的作用[5]。非转录区又称基因间隔区IGS(intergenic spacer)，它将相邻的两个重复单位隔开，在转录时有启动和识别作用。

整个rDNA基因簇从5'到3'，端依次为基因间隔区IGS(包括在18S rDNA基因上游的ETSl和在28SrDNA基因下游的ETS2)；位置可变的5SrDNA基因；18S rDNA基因；ITSl序列；5.8S rDNA基因；ITS2序列，以及28S rDNA基因[6]。

　　2．ITS序列在真菌分子系统学研究中的应用

　　18S、5．8S、28S rDNA基因序列进化缓慢而相对保守，但这三个基因序列之间的ITS序列的进化则相当迅速，因而rDNA序列广泛用于真菌各级水平的系统学研究。

18S rDNA和28S rDNA分别约为1.8lb和3.4kb，序列中既有保守区又有可变区，在进化速率上比较保守，其中18S比28S基因更保守，是在系统发育中种级以上阶元的良好标记[8]。5.8S基因分子量小且高度保守，较少用于系统学研究[7]。但它为真菌rDNAPCR扩增的通用引物的设计提供了极大的方便[4， 6]。

　　由于ITS区不加入成熟核糖体，所以受到的选择压力较小，进化速率较快，在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性。同时ITS序列长度适中，从人类到酵母的各种真核生物中ITS的序列长度为1000bp到小于300 bp大小不等，人们可以从不太长的序列中获得足够的信息，可广泛用于属内种间或种内群体的系统学研究[6]。

　　目前使用ITS区作为分子标记的主要方法有DNA序列测定分析和PCR-RFLP分析。

　　Belloch等[9]使用ITS序列测定分析技术，分析了分别属于Kluyveromyces aestuarii，.dobzhanskii，k. lactis，k. marxianus，k. nonfermentans和k.wickerhamii六个种的39个菌株以研究它们的分子进化关系，在分子水平上鉴别了k. lactis的两个变种k. lactis var．1actis和k. lactis var．drosophila-rum。

目前认为，前者主要为分离自乳制品的乳糖阳性菌株，后者则由昆虫和植物分泌物中分离得到的乳糖阴性菌株。 Belloch等[9]的结果表明，目前认为的K lactis实际上是一个包含不同种、亚种的复合菌群。Trichophyton是一类能侵入角质化组织中并引起癣病的真菌，共有40多个种。

人们曾使用基因组DNA的C+C含量、线粒体DNA的RFLP分析，以及18S、28S确rDNA序列比较等方法对其进行研究，但仍有部分种难以鉴定。 Graoser等[10]使用ITSl和ITS2两个区间的序列成功地研究了该属的53株菌，结果将它们分别归为38个种并通过形态学及生理生化特征证实了ITS序列分析的可行性。

Chen等[11]应用ITS序列对来自40个种的141株酵母真菌进行了分子系统学研究。

通过自动毛细管电泳对菌株ITS序列PCR产物的分析发现：由ITS-1区序列长度多态性提供的信息可将这些菌株分为19个种，由ITS-2区序列长度多态性提供的信息可将这些菌株分为 16个种，而ITS全序列长度多态性提供的信息可将这些菌株分为30个种。进一步通过对ITS-1序列测序分析则可将其准确地分为40个种。

　　在国内的研究中ITS序列的应用也取得了很大的进展。祝明亮等利用PCR-RFLP方法对捕食线虫真菌节丛孢属、隔指孢属进行了系统发育研究，结果体现了属内不同种间的亲缘关系，从分子水平证实了节丛孢属、隔指孢属形态分类学的合理性，同时对节丛孢属的属征扩大提出疑义[12，13]。

Trichoderma．harzianum是木霉属内最常见的一个“集合种”，章初龙等[14]对来源不同的T.harzianum及其相似种的46个菌株进行了ITS序列测定，结果表明，T.harzianum及其相似种可分成A、B2个群：A群由T.hamatum、T.asperellum、 T.atroviride、T.koningii和T.viride组成，并形成2个分支；B群由T.spit-ale、T. inhamatum、T.harzianum、T. hamatum和T.aFlam组成，并形成6个分支。

陈永青等””采用随机扩增多态性技术和核搪体基因rDNA转录间隔区ITS序列分析，对22种拟茎点霉共34个菌株进行了系统发育研究。可以清楚地将分自7科寄主植物上的不同的种分别区分开来，但分自同科或同届寄主植物上的不同的种并不具有相近的亲缘关系。

另外，对相同的供试菌株两技术所反映的亲缘关系趋势相同，表明两技术用于拟茎点霉的亲缘关系分析和种类鉴定均是可行的。

　　3．ITS序列在真菌病原学研究中的应用

　　近年来，新药的临床应用迫切要求发展新的病原真菌的鉴定手段，在最短的时间里将致病菌鉴定到种的水平，以选择敏感有效的药物进行治疗[16]。ITS序列分析技术由于快速、简便和高特异性显示出了极大的优势。

　　Trotha等[17]使用ITS序列分析方法成功地从一位面部深层感染而引起脓肿溃疡的患者身上鉴定出了病原真菌 Trichophytoninterdigitale，从而通过新的抗生素联合疗法使此前由于未能准确找出病原菌而导致的感染扩散顺利解决，患者得到治愈。

Sugita等[18]使用ITS序列分析方法重新鉴定了Cryptococ―Ctt$albidus的19个菌株，其中包括9株临床分离物。结果将 19个菌株分为C albidus和C.diffluens两个种，其中一个分离自一位AIDS病患者血液的菌株被认为是一个新种，它的生化特征与C albidus和C.diffluens的区别极为微小。

Tamura等[19]对分离自两位患者体内的两个Histoplasmacapsulatum 菌株与来自其他地域的30个H.capsulatum参考菌株一起进行了分子流行病学研究。

RAPD分析显示两个临床菌株的带型与参考菌株一致，随后他们采用ITS序列分析方法，结果将32个菌株分为8组，分别为亚洲型、南美洲型A、南美洲型B、北美洲型1、北美洲型2、H.duboisiiA、且 duboisiiB和东亚型，而两个临床菌株属于东亚型。

　　根据大量的研究工作，人们设计出了许多致病真菌的种、属特异性探针或引物，同时发展出一些新的检测手段以用于临床诊断。

Martin等[20]近来发展了一种排列探针逆杂交检测法(Reverse-Hybrid― izationlineassay)，在ITS-PCR的基础上，检测出了大量重要的Candida属致病真菌，其灵敏度达到检测样品最低浓度2-10个细胞／毫升。分子信标(Molecularbeacons)是又一种新的检测技术。

它是一种小的核酸发夹环状探针，当其特异地与标靶序列结合时能够产生明亮的荧光。Park等[21]使用基于ITS2序列的种特异性分子信标快速鉴定了C.al-bicans和C.dubliniensis的23个菌株，准确率达100％。

　　我国王英等[22]采用两对内转录间隔区ITS的种特异性引物和通用引物对念珠菌悬浮液进行扩增。结果发现，采用通用引物结合快速检测法可快速、简便、特异、敏感地检测出念珠菌，并能同时鉴定到种，这对念珠菌病的早期诊断和治疗有潜在的应用价值。

彭慧等[23]为探明一例眼外伤摘除的眼球活组织中培养分离出的一株形态特异的尖端赛多孢子菌的分子生物学特征，及其与波氏假阿利什菌、一般尖端赛多孢子菌标准株的亲缘关系，采用PCR-RFLP方法对10个菌株的ITS序列进行了分析。

结果发现，形态特异的尖端赛多孢子菌与标准株及其他同种菌株具有相同的酶切图谱，从而证实该标准菌株的ITS序列酶切图谱可供快速、准确地鉴定尖端赛多孢子菌，以便于临床早期诊断。

　　4.前景与展望

　　随着分子生物学的飞速发展，近年来已发展的一些全新的DNA测序方法，如毛细管凝胶电泳法、陈列毛细管凝胶电泳法、超薄层凝胶板电泳法；以及杂交法、质谱法、原子探针法、流动式单分子荧光检测法等已应用到ITS序列分析中[24]，同时生物信息学的进步也将使对分析结果的处理更加准确可。

　　目前，以ITS序列作为分子标记的应用技术的最大限制是，有的真菌由于进化顺序、变异，甚至分析方法等原因，在间隔区上表现的差异性较小，不适合于属内种及种群的标记；另外，在一些真菌的不同地理、不同寄生宿主型别的鉴定上也存在困难[25]。这些都将依赖ITS序列应用研究的进一步发展。