生物大分子的离心分离实例

例（ 1 ）去蛋白的 RNA 分离：

（ i ） 样品匀浆加入 9 倍容积的冰冷 20mM Tris-HCl （ PH8.0 ） 1mMEDTA 。

（ ii ） 加入 1/10 容积的 10% SDS ，再加入等容积的（苯酚：氯仿：异丙醇）（容积比 50 ： 50 ： 2 ）溶液并含有 0.1% 的 8- 羟基喹啉溶液充分混合使其乳化。

（ iii ） 以上溶液在 10,000xg 离心 10 分钟。

（ iv ） 移出上清液，重复（ ii ）（ iii ）过程一次。

（ v ） 第二次离心后上清液中加入 1/10 容积的 3M 醋酸铵，充分混合后再加入二倍容积的乙醇，并在 -20 ℃ 静置二小时以上。

（ vi ） 10,000xg 5 ℃ 离心10 分钟得到 RNA 沉淀。

（ vii ） 用干燥的 N2 气体蒸发掉沉淀中残留的乙醇。

（ viii ） 将 RNA 溶于 20mMTris-HCl （ PH8.0 ）， 1mMEDTA 中， -20 ℃ 低温保存待用。

例（ 2 ）从大肠杆菌中分离质粒 DNA ：

（ i ） 溶液制备：

溶液 I ： 50mM 葡萄糖， 10mM （ EDTA ）， 25mM Tris-HCl （ PH8.0 ）

溶液 II ： 0.2M NaOH ， 1% SDS

溶液 III ： 3M 醋酸纳（ PH4.8 ）

TE 缓冲液： 10mMTris-HCl （ PH7.4 ）， 2mM EDTA

（ ii ） E. Coli 培养液 1 升 （量大按比例配置）

（ iii ）将 1 升 培养液在 4,000rpm （约 2,000xg ）， 5 ℃ 离心 20 分钟，得到细菌沉淀。

（ iv ）用 100ml 冰冷的溶液 I “洗”沉淀，再次离心， 4,000rpm ， 5 ℃ ， 20 分。

（ v ）用 20ml 冰冷溶液 I 将第二次离心沉淀调成均匀悬浮液。

（ vi ）每 ml 悬浮液加入 2mg 溶菌酶，并在 0 ℃ 冰浴中放置 10 分钟。

（ vii ）加入 40ml 溶液 II ，轻轻搅拌后，在冰浴中放置 5 分钟。

（ viii ）加入 30ml 溶液 III ，在冰浴中放置 20 分钟，使蛋白质大部分沉降。

（ ix ）在高速冷冻离心机上用角式转头， 10,000rpm （约 10,000xg ）离心 15 分钟， 5 ℃ 。

（ x ）小心地倒去上清（不扰动沉淀），在沉淀中加入 55ml 异丙醇，即得到粗制的质粒 DNA 溶液。

（ xi ）粗制 DNA 液在 -20 ℃ 静置 15 分钟以上，再在 12,000rpm （约 15,000xg ） 4 ℃ 离心 5 分钟，倒去上清液。

（ xii ）真空中抽去异丙醇，沉淀中加入 18ml 经过消毒的 TE 缓冲液，在沉淀溶解后再加入 0.65ml ， 1% E.B.

（ xiii ）以上溶液每 ml 加入分析纯 CsCl 1 克 ，使其完全溶解，检测溶液折射率应为1.3890 （密度≈ 1.587 ）

（ xiv ）用以上溶液按照参考文献（ 6 ）所介绍的方法作质粒 DNA 分离。

（ xv ）离心后在 300nm 紫外光下可显示 DNA 带（线性 DNA 带和质粒 DNA 带， RNA 沉淀在底部，蛋白质浮在液面）。

（ xvi ）用文献（ 1 ）介绍的方法取出质粒 DNA ，抽提去掉 E.B. 透析法或脱盐柱去除 CsCl 。

例（ 3 ）用 CsCl 梯度分离 DNA 并测定其组成（ % G+C ）

（ i ） CsCl 溶液密度 D 与溶液中 CsCl 的重量百分比浓度 P 之间的关系： D=138.11/ （ 137.48-P ）

（ ii ） 制备初密度为 1.706 克 / 毫升的梯度液，应按以下要求配置

4.85 克 CsCl （分析纯）

50 μ l ， 1.0M Tris-HCl （ PH7.4 ）

20 μ l ， 0.2M EDTA （ PH7.4 ）

0.5ml DNA 样品

3.3ml 重蒸水

（ iii ） 用光折射仪检测 CsCl 的初始密度 D ，设测得的光折射率为 RI ，则有 D=10.8601 × RI-13.4974

（ iv ） 测得的 RI 应为 1.4000 ，如果检测值大于此值，再加重蒸水容量为 V （毫升），梯度液的总容量为 G （毫升）， V=1.52 × G ×（ D 测定 -D 需要），如果检测值小于 1.4000 ，那么再加固态 CsCl （ W ）克

W=1.32 × G ×（ D 需要 -D 测定）

（ v ） 再测溶液折射率直至调整 RI=1.4000

（ vi ） 将配置好的液体充满于 5ml 的一次性快速密封离心管，并利用封口机密封。

（ vii ） 固定角式转头 150,000xg ， 20 ℃ 离心 50~55 小时（约 35,000rpm ）或垂直管转头 300,000xg ， 20 ℃ 离心 12 小时（约 55,000rpm ）

（ viii ） 离心后利用梯度仪或手工收集成 50 管（每管 100 μ l ）。

（ ix ） 对每管样品测定折射率至小数 4 位，测试过程中应保持样品温度为 20 ℃ ，根据折射率 RI 计算各管样品的密度 D 。

（ x ） 每管中加 1 毫升重蒸水，在 260nm 波长时分别测各管光密度（ OD ），如果 DNA 已做了同位素标记，那么还要对收集的样品分别做液体闪烁计数仪测定辐射值。

（ xi ） 以离心管容量为横坐标（从管底至管面），分别以各管测得的 OD 值或同位素放射计数值为纵坐标作曲线。找到曲线的峰值位置即可做 DNA 定位。

（ xii ） 用下式计算 DNA 组成：

　　% （ G+C ） = （ D-1.66 ） /0.098 × 100
如果能在离心样品中加入标准 DNA ，计算就更加准确。

说明：

进入90 年年代以后用 DNA 测序法或在 260nm 波长加温溶点法进行测定比离心法更简单，究竟用什么方法要由使用单位现有设备来决定。在不用 E.B. （溴乙锭）的情况下，用 CsCl 梯度分离 DNA 一般不会影响 DNA 的构型。某些梯度材料如 Cs 2 SO4 在离心过程中形成的密度梯度太陡而不适合做质粒 DNA 离心。某些非电离性的梯度材料（如 Nycodenz ）也不适用于此类离心。

例（ 4 ）用 CsCl 梯度纯化 RNA
　　配置溶液：
　　I ： 7.5M 氯胍， 50mM 醋酸纳（ PH7.0 ）
　　0.1M 2- 巯基乙醇， 0.5% Sarkosyl 。
　　II ： 10mMTris-HCl （ PH7.4 ）， 2Mm EDTA 。

实验步骤

（ i  ）在溶液 I 中制备细胞匀浆 , 每克细胞加入 10ml I 溶液 .
　　（ ii  ） 匀浆离心 , 8,000rpm( 约 8,000xg), 5 ℃ ,10 分钟 , 固定角式转头 ,PA 或 PP 离心管。离心后倒出上清液备用。
　　（ iii ）用容量为 13-14ml ，最高转速在 40,000-41,000rpm 的甩平转头，钛合金吊桶， PA 离心管，每管下部铺设 2ml ， 5.7M CsCl （在溶液 II 中），上部为（ ii ）离心后的上清液。离心转速 31,500rpm （约 185,000xg ）， 10 ℃ 离心 18 小时，或用固定角式转头，每管下部铺设 3ml ， 5.7M CsCl （在 II 中），上层的（ ii ）离心后的上清液， 65,000rpm （约 410,000xg ）， 10 ℃ ，离心 2 小时（慢加速，慢减速）。
　　（ iv ）离心后，小心地倒去上层蛋白质，中层的 DNA ，已经初步纯化的 RNA 沉淀在离心管底部。
　　（ v ）沉淀中加入 0.5ml 溶液 I 并移入 1.5ml eppendorf 管，再在微量离心管中加入 0.5ml 溶液 I ，摇匀。
　　（ vi ）在离心管中加 50 μ l ， 1M 醋酸（在 500 μ l 乙醇中）。
　　（ vii ）离心管置于低温冰箱中 -20 ℃ 静置 1 小时以上。
　　（ viii ）台式离心机 12,000rpm （约 11,000xg ）离心 10 分钟。倒去上清液，沉淀为 RNA （进一步纯化的）。
　　（ ix ）沉淀溶于 400 μ l 溶液 II 并假如 40 μ l 3M 醋酸纳（ PH5.0 ）（在 880 μ l 乙醇中）。
　　（ x ） -20 ℃ 静置过夜。
　　（ xi ）第二天，用高速台式离心机 12,000rpm （约 11,000xg ）离心 10 分钟，倒去上清液，沉淀用 70% 乙醇洗二次。
　　（ xii ）将 RNA 溶于 II ，用凝胶电泳检测（用薄层扫描仪或凝胶电泳分析仪分析结果） RNA 构型，用分光光度计（ 1 毫克 / 毫升 RNA 在 260nm 时光密度为 25 ）测定 RNA 浓度。
　　（ xiii ）将已知构型及浓度的 RNA 在 -20 ℃ 储存。

例（ 5 ）：用 KI 梯度分离 RNA 片断。
　　（ i ） 将 DNA 样品溶于 15mM 柠檬酸钠， 10mM 亚硫酸钠， 5mML 磷酸钠（ PH7.0 ）中，最终浓度不超过 50 μ g/ml 。
　　（ ii ） 每毫升 RNA 溶液加入 1.0 克 KI ，充分溶解后用折射仪测定 RI=1.4290 ，如过高，过低必须修正到比值。
　　（ iii ） 将以上溶液充满 12ml ， PA 快速密封离心管，密封后置于固定角式转头中， 150,000xg ， 20 ℃ 离心 60 分钟。
　　（ iv ） 分部收集离心管中梯度液（ 30-50 管），可用 RNA 试剂定位，如果 RNA 已做同位素标记，可用液闪仪定位。如果用后一种方法，在分部收集管每管中加一滴（ 25 μ l 左右）巯基乙醇以避免在液闪仪液体中产生自由离子。
　　（ v ） 用此法可以分离单股与双股 RNA 。

例（ 6 ）用 Cs2SO4 及尿素作梯度材料分离生物大分子
　　样品：初步离心后的蛋白 - 核酸混合液
　　梯度液： 3.00g Cs2SO4
　　2.5ml 8M 尿素（经过混合床去离子处理的）
　　50 μ l 1.0M Tris-HCl （ PH7.4 ）
　　25 μ l 0.2M EDTA （ PH7.4 ）
　　1.25ml 样品的水溶液
　　以上各项充分混合后注入 5ml PA 快速密封管
　　固定角式转头 130,000xg ， 5 ℃ 离心 64 小时，慢减速或 600,000xg ， 5 ℃ 离心 14 小时，慢减速甩平转头      400,000xg ， 5 ℃ 离心 22 小时

结果分析：其中蛋白用 35S 同位素标记。RNA ， DNA 用 32P 同位素标记。离心后样品分布收集成 30 管，在液闪仪上测定，绘出从离心管表面— > 管底的容量为横坐标，同位素 32P ， 35S 计数为纵坐标的曲线图，很明显可以找到蛋白， DNA ， RNA 的峰位置。

 例（ 7 ）用 RbCl 梯度分离不同密度的蛋白质：

配置：样品：经过初步分离的蛋白质 50 μ g-200 μ g
　　1.75g    RbCl
　　0.5ml   1M     Tris-acetate （ PH7.1 ）
　　水容量 =3.25ml                      
　　（充分混合后注入离心管）
　　固定角式转头， 5ml PA 管 
          　　   250,000xg ， 5 ℃ 65 小时 ，慢减速 
          　　 或 600,000xg ， 5 ℃ 27 小时 ，慢减速 
  　　 甩平转头   400,000xg ， 5 ℃ 42 小时 
   　　离心后沿离心管长度方向分部收集成 50 管。
　　用分光光度计分别测各管 O.D. 值，以管容量为横坐标， O.D. 值为纵坐标绘制曲线，可以找到各种蛋白的峰位置。

例（ 8 ）用 CsCl-Cs2SO4 梯度分离 RNA 片断：
　　配置：
　　1.9ml 饱和的 CsCl 液
　　1.7ml 饱和的 Cs2SO4 液
　　1.15mlRNA 样品（ 5-10 μ g 溶于 0.1M Tris-HCl （ PH7.5 ）及 10mM EDTA ）
　　0.25ml DMSO （ 5% ）
　　充分混合后注入 5ml PA 离心管
　　离心二次：          第一次   170,000xg ， 25 ℃ ， 18 小时 （固定角式转头）
　　第二次   100,000xg ， 25 ℃ ， 48 小时（固定角式转头）
　　离心后沿离心管长度方向收集 30-50 管，用比重计测密度。
　　（因为是 CsCl 与 Cs2SO4 混合梯度，不能用光折射仪测 RI ）。
　　结果：横坐标为管容量，纵坐标为密度绘制曲线，可以找到不同密度 RNA 所在位置。

例（ 9 ）用 NaBr 梯度分离血清脂蛋白：
　　（ i ） 溶液配置：
　　干燥的 NaBr 晶体，在 210 ℃ 恒温箱中过夜，分别配置下列不同密度的 NaBr 液体：
　　1.006 克 / 毫升（ 9 克 / 升）
　　1.019 克 / 毫升（ 27 克 / 升）
　　1.063 克 / 毫升（ 95 克 / 升）
　　1.210 克 / 毫升（ 283.4 克 / 升）
　　1.386 克 / 毫升（ 524.8 克 / 升）
　　所有的溶液均含 0.05% EDTA （ PH7.0 ），溶液经过滤后储存在暗褐色瓶中， 4 ℃ 保存。
　　（ ii ） 实验过程
　　（ 1 ） 人全血 1,000xg 离心 10 分钟去除各种血细胞，上清液为血清。
　　（ 2 ） 0.2ml 血清与 0.8ml ， 1.386 克 / 毫升的 NaBr 液混合。
　　（ 3 ） 将已稀释的血清样品 1ml 置于 14mlPA 管底部，然后往上依次铺设梯度液 
        　　    3.2ml ， 1.21g /ml NaBr 液
　　　    　3.8ml ， 1.063g /mlNaBr 液
　　　   　3.3ml ， 1.016g /ml NaBr 液
　　　   　1.2ml ， 1.006g /ml NaBr 液
　　（ 4 ） 甩平转头， 260,000xg ， 14 ℃ ， 24 小时
        各种密度的脂蛋白从管底浮向它们自己的等密度区形成了纯的各种密度脂蛋白区带。而离心管底部保留着各种血清蛋白。
　　（ 5 ） 用上排法从离心管中抽出各层液体，由蠕动泵输送经过带流动池的紫外 - 可见分光光度计经检测光密度（ O.D. ）值后用　　部分收集器收集于 0.5ml eppendorf 管中。
　　（ 6 ） 从分光光度计的 O.D. 曲线，可以从 0.5ml 离心管中给各种不同密度血清脂蛋白定位。
　　（ 7 ） 结果：
　　血清脂蛋白
　　代号及名称 收集管编号 从 14ml 离心管上液面向下计算的容积（ ml ）
　　VLDL （极低密度脂蛋白） 1-2 0.5-1.0
　　IDL （较低密度脂蛋白） 3-4 1.5-2.0
　　LDL （低密度脂蛋白） 5-9 2.5-4.5
　　HDL1 （高密度脂蛋白） 10-12 5.0-6.0
　　HDL2 （较高密度脂蛋白） 13-17 6.5-8.5
　　HDL3 （极高密度脂蛋白） 18-20 9.0-10.0
　　（ 8 ）也可以用 NaBr 的连续梯度（从 1.003 克 / 毫升 -1.200 克 / 毫升）来进行血清脂蛋白分离，甩平转头， 95,000xg ， 4 ℃ ， 2 小时，也可以得到类似结果。