生物大分子的离心分离实例

例（ 1 ）去蛋白的 RNA 分离：

（ i ） 样品匀浆加入 9 倍容积的冰冷 20mM Tris-HCl （ PH8.0 ） 1mMEDTA 。

（ ii ） 加入 1/10 容积的 10% SDS ，再加入等容积的（苯酚：氯仿：异丙醇）（容积比 50 ： 50 ： 2 ）溶液并含有 0.1% 的 8- 羟基喹啉溶液充分混合使其乳化。

（ iii ） 以上溶液在 10,000xg 离心 10 分钟。

（ iv ） 移出上清液，重复（ ii ）（ iii ）过程一次。

（ v ） 第二次离心后上清液中加入 1/10 容积的 3M 醋酸铵，充分混合后再加入二倍容积的乙醇，并在 -20 ℃ 静置二小时以上。

（ vi ） 10,000xg 5 ℃ 离心10 分钟得到 RNA 沉淀。

（ vii ） 用干燥的 N2 气体蒸发掉沉淀中残留的乙醇。

（ viii ） 将 RNA 溶于 20mMTris-HCl （ PH8.0 ）， 1mMEDTA 中， -20 ℃ 低温保存待用。

例（ 2 ）从大肠杆菌中分离质粒 DNA ：

（ i ） 溶液制备：

溶液 I ： 50mM 葡萄糖， 10mM （ EDTA ）， 25mM Tris-HCl （ PH8.0 ）

溶液 II ： 0.2M NaOH ， 1% SDS

溶液 III ： 3M 醋酸纳（ PH4.8 ）

TE 缓冲液： 10mMTris-HCl （ PH7.4 ）， 2mM EDTA

（ ii ） E. Coli 培养液 1 升 （量大按比例配置）

（ iii ）将 1 升 培养液在 4,000rpm （约 2,000xg ）， 5 ℃ 离心 20 分钟，得到细菌沉淀。

（ iv ）用 100ml 冰冷的溶液 I “洗”沉淀，再次离心， 4,000rpm ， 5 ℃ ， 20 分。

（ v ）用 20ml 冰冷溶液 I 将第二次离心沉淀调成均匀悬浮液。

（ vi ）每 ml 悬浮液加入 2mg 溶菌酶，并在 0 ℃ 冰浴中放置 10 分钟。

（ vii ）加入 40ml 溶液 II ，轻轻搅拌后，在冰浴中放置 5 分钟。

（ viii ）加入 30ml 溶液 III ，在冰浴中放置 20 分钟，使蛋白质大部分沉降。

（ ix ）在高速冷冻离心机上用角式转头， 10,000rpm （约 10,000xg ）离心 15 分钟， 5 ℃ 。

（ x ）小心地倒去上清（不扰动沉淀），在沉淀中加入 55ml 异丙醇，即得到粗制的质粒 DNA 溶液。

（ xi ）粗制 DNA 液在 -20 ℃ 静置 15 分钟以上，再在 12,000rpm （约 15,000xg ） 4 ℃ 离心 5 分钟，倒去上清液。

（ xii ）真空中抽去异丙醇，沉淀中加入 18ml 经过消毒的 TE 缓冲液，在沉淀溶解后再加入 0.65ml ， 1% E.B.

（ xiii ）以上溶液每 ml 加入分析纯 CsCl 1 克 ，使其完全溶解，检测溶液折射率应为1.3890 （密度≈ 1.587 ）

（ xiv ）用以上溶液按照参考文献（ 6 ）所介绍的方法作质粒 DNA 分离。

（ xv ）离心后在 300nm 紫外光下可显示 DNA 带（线性 DNA 带和质粒 DNA 带， RNA 沉淀在底部，蛋白质浮在液面）。

（ xvi ）用文献（ 1 ）介绍的方法取出质粒 DNA ，抽提去掉 E.B. 透析法或脱盐柱去除 CsCl 。

例（ 3 ）用 CsCl 梯度分离 DNA 并测定其组成（ % G+C ）

（ i ） CsCl 溶液密度 D 与溶液中 CsCl 的重量百分比浓度 P 之间的关系： D=138.11/ （ 137.48-P ）

（ ii ） 制备初密度为 1.706 克 / 毫升的梯度液，应按以下要求配置

4.85 克 CsCl （分析纯）

50 μ l ， 1.0M Tris-HCl （ PH7.4 ）

20 μ l ， 0.2M EDTA （ PH7.4 ）

0.5ml DNA 样品

3.3ml 重蒸水

（ iii ） 用光折射仪检测 CsCl 的初始密度 D ，设测得的光折射率为 RI ，则有 D=10.8601 × RI-13.4974

（ iv ） 测得的 RI 应为 1.4000 ，如果检测值大于此值，再加重蒸水容量为 V （毫升），梯度液的总容量为 G （毫升）， V=1.52 × G ×（ D 测定 -D 需要），如果检测值小于 1.4000 ，那么再加固态 CsCl （ W ）克

W=1.32 × G ×（ D 需要 -D 测定）

（ v ） 再测溶液折射率直至调整 RI=1.4000

（ vi ） 将配置好的液体充满于 5ml 的一次性快速密封离心管，并利用封口机密封。

（ vii ） 固定角式转头 150,000xg ， 20 ℃ 离心 50~55 小时（约 35,000rpm ）或垂直管转头 300,000xg ， 20 ℃ 离心 12 小时（约 55,000rpm ）

（ viii ） 离心后利用梯度仪或手工收集成 50 管（每管 100 μ l ）。

（ ix ） 对每管样品测定折射率至小数 4 位，测试过程中应保持样品温度为 20 ℃ ，根据折射率 RI 计算各管样品的密度 D 。

（ x ） 每管中加 1 毫升重蒸水，在 260nm 波长时分别测各管光密度（ OD ），如果 DNA 已做了同位素标记，那么还要对收集的样品分别做液体闪烁计数仪测定辐射值。

（ xi ） 以离心管容量为横坐标（从管底至管面），分别以各管测得的 OD 值或同位素放射计数值为纵坐标作曲线。找到曲线的峰值位置即可做 DNA 定位。

（ xii ） 用下式计算 DNA 组成：

　　% （ G+C ） = （ D-1.66 ） /0.098 × 100
如果能在离心样品中加入标准 DNA ，计算就更加准确。