个别组织细胞的培养

体内组织细胞在体外培养时，所需培养环境基本相似，但由于物种、个体遗传背景及所处发育阶段等的不同，各自要求条件有一定差别，所采取的培养技术措施亦不尽相同，现介绍个别组织细胞培养的要点如下：

一、上皮细胞培养

上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮组织，故上皮细胞培养特别受到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞，培养时生长速度往往超过上皮细胞，并难以纯化，同时上皮细胞难以在体外长期生存，因此纯化和延长生存时间是培养关键。

体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜，因此培养在有胶原的底物上可能利于生长，另外人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养层（用射线照射后）时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低PH、Ca2 含量和温度，向培养基中加入表皮生长因子，均有利于表皮细胞生长。

以表皮细胞为例，用皮肤表皮和真皮分离培养法可获得纯上皮细胞，其法如下（黑木凳志夫 1981）

1、取材：外科植皮或手术残余皮肤小块，早产流产儿皮肤更好，取角化层薄者，切成0.5-1平方厘米小块。

2、置0.02�A中，室温，5分钟。

3、换入0.25%胰蛋白酶中，4℃过夜。

4、分离：取出皮块，用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。

5、取出表皮，剪成更小的块后，置0.25%胰酶中，37℃，30-60分钟。

6、反复吹打，制成悬液。

7、培养：用80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸去上清。

8、直接加入培养基（Eagle加20%小牛血清）制成细胞悬液，接种入培养瓶，CO2温箱培养。

二、内皮细胞培养

内皮细胞易于从大血管分离培养成单层细胞，对于研究内皮细胞再生、肿瘤促血管生长因子（TAF）等有很大价值。

研究人内皮细胞培养以人脐带静脉灌流消化法最为简便，其法如下：

1、产后新鲜脐带，无菌剪取10―15厘米长一段，如不能立即培养，可于12小时内保存于4℃。

2、用三通注射器吸取温PBS液注入脐静脉中洗去残血，在入口处用线绳扎紧，以防液体返流。

3、用血管钳夹紧脐带一端，从另一端向脐静脉中徐徐注入终浓度为0.1%的粗制胶原酶，充满血管，消化3-10分钟；注入口用线绳扎，以防液体返流。

4、吸出含有内皮细胞的消化液，于离心管中，注入温PBS轻轻反复冲洗后，一并注入离心管中（此步骤可重复）。

5、离心去上清，加入RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置温箱培养。两至三天可见细胞长成单层。

三、神经胶质细胞培养

神经细胞（神经元）不易培养，只有在适宜情况下，如接种在胶原底层上，或加入神经生长因子和胶质细胞因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象，但很难使之增殖。而神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。

人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养，不仅能获得生长的胶质细胞，也可形成能传代的二倍体细胞系。一般说来，胶质细胞在培养中生长不稳定，不易自发转化，但对外界因素仍保持很好的敏感性，可用ROUS病毒和SV4等诱发转化。

培养方法如下：

1、从手术室无菌取脑髓灰质或白质后，仔细剥除脑膜、血管和纤维成分，置Hanks液中漂洗一、二次。

2、置于30―50倍体积的Hanks液中，此时脑组织比较柔软，反复吹打即制成细胞悬液。

3、把悬液注入离心管室温中直立5-10分钟后，细胞或细胞团快自然下沉，脂肪等杂物易漂浮，可吸除上层、反复二、三次，即可排除脂肪成分和其它碎块并获较多细胞成分。

4、在沉降物中加入适量培养液，通过纱网成纱布过滤，计数并调整细胞密度。

5、接入培养瓶或皿中，置5%CO2温箱中培养。

该细胞适应环境过程较长，接种后贴壁较慢。贴壁后短期内也可能不见细胞分裂现象，然而一旦生长后即能迅速进入旺盛的增殖状态。细胞传代可以0.25%胰酶消化处理。

四、肌组织培养

各种肌组织均可用于培养，以心肌和骨骼肌较实用。

（－）骨骼肌细胞培养

1、出生1一2天的乳鼠，引颈处死。

2、无菌取大腿肌组织，切成0.3-0.5cm²小块后，用不含钙镁离子的Hanks液配的0.25%胰蛋白酶消化，无菌纱网或纱布滤过。

3、计数调整细胞密度。

4、快接种量2×106/皿入培养基培养。

5、培养基内含10%小牛血清，可加1%的胎汁以促进分化。

接种在胶原或胶原的底物上能促进细胞分化，明胶配置：用Hanks液配成0.01%明胶。

该细胞接种率约50%，细胞生长开始呈纺锤形，培养50-52小时后出现融合形成肌细胞状多核纤维。数日后融合停止，此时可观察到横纹，一般在融合后二、三天内能见到收缩现象。

（二）心肌细胞培养

心肌细胞是最早的培养材料，Carrel曾长期培养过心肌组织，至今心肌仍不失为好的培养物，最常用的是鸡胚心肌。

心肌比较容易培养和生长，可用悬滴培养、组织块培养和消化培养法，均可获良好的效果。取心室肌培养较好，原代培养的鸡胚心肌呈纺锤形，培养成功时，一周后可见节律性收缩现象。

五、巨噬细胞培养

巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2-3周，多用做原代培养，难以长期生存。

巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。

培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，以小鼠腹腔取材法最为实用，其法如下：

1、实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤lml（勿注入肠内！），以刺流产生大量的巨噬细胞。

2、引颈处死小鼠。

3、手提鼠尾将其全浸入70%乙醇中3-5秒。

4、置动物于解剖台，用针头固定四肢，持镊撕开腹部皮肤，但勿伤及腹膜壁，把皮肤拉向上下两侧，暴露出腹膜壁。

5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同时用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动。

6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧．使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。

7、小心拔出针头，把液体注入离心管。

8、4℃下250g离心10分钟后，去上清，加10ml Eagle培养基。

9、计数细胞。每只鼠可产生20-30×106细胞，其中90%为巨噬细胞。

10、以3×105个贴附细胞/平方厘米接种。

11、接种数小时后，除去培养液，可去除其它白细胞，纯化培养细胞，用Eagle液冲洗1-2次，再加新Eagle培养液置CO2温箱中。

六、肾小球分离、移植培养

SD 大鼠颈椎脱臼法处死，75%乙醇浸泡1～2分钟，2次，置超净台内，打开腹腔取出肾脏剪碎，置含Hank's液的无菌培养皿洗涤，置80目不锈钢筛网上。用扁平自制小铲轻轻碾磨产物微小组织透过筛网，滤过组织Hank's液混合物用吸管吸至120目不锈钢筛网，滤过，去小组织块，滤过物吸至200目不锈钢筛网，轻轻滤过，Hank's液洗涤1次，收集网上肾小球，镜下观察为分离良好的肾小球。肾小球用0.2%胰酶、0.1%胶原酶，37℃消化20分钟，加血清终止胰酶反应，离心除去胶原酶。处理过的肾小球计数后接种至24孔培养板或25ml培养瓶，使肾小球大于60个/cm2，加培养基5～10ml（培养基组成：F12―3T3上清1：1；5%马血清；2.5%胎牛血清；胰岛素5μg/ml；25ng/ml氢化可的松；5μg/ml转铁蛋白；25ng/ml前列腺素E1；甲状腺素0.02ng/ml；D-缬氨酸150ng/ml）肾小球培养8～10天，去除肾小球未生长组分，细胞继续培养24 小时，形态学观察：细胞生长成单层多角型细胞，直径约100μm。

七、裸小鼠移植瘤单细胞分离培养

无菌条件下取出小鼠移植瘤组织，剪成1mm³小块，用0.5%胶原酶室温消化30分钟到1小时，再加等体积0.2%胰酶消化5～8分钟，在消化过程中用吸管吹打组织块或用自制装置（分别作为加样和收集器的两个注射器中间加一小滤器连接而成，滤器中间垫两层丝质材料以隔断组织块与单细胞）来回推动注射器吹打组织以分离单细胞，终止酶消化方法同上。常规方法接种培养收获细胞。