补体法免疫荧光组织化学染色步骤

1．材料

① 免疫 血清60℃灭活20分钟，用Kolmers盐水作2倍稀释成1:2、1:4、1:8或更高。如免疫血清补体结合的效价为1:32，则免疫血清应作1:8稀释。Kolmers盐水配制：在pH 7.4，0.1mol/L的磷酸缓冲盐水中溶解MgSO4 ，含量为0.01%；

② 补体用新鲜豚鼠血清，一般作1:10稀释或按补体结合反应试管法所测定的结果，按2单位的比例，用Kolmers盐水稀释备用；

③ 抗补体荧光抗体：在免疫血清效价为1:4，补体为2单位的条件下，用补体染色法测定免疫豚鼠球蛋白荧光抗体的染色效价，然后按染色效价1:4的浓度用Kolmers盐水稀释备用。

2．操作步骤

① 涂片或切片固定；

② 吸取经适当稀释的免疫血清与补体等量混合液(此时免疫血清及补体均稀释1倍)滴于切片上，置于湿盒内，37℃孵育30分钟；

③ 用缓冲盐水振荡洗涤2次，每次5分钟，吸干标本周围水液；

④ 滴加经过适当稀释的抗补体荧光抗体，37℃孵育30分钟，水洗同上；

⑤ 蒸馏水洗1分钟，甘油缓冲液封固。

3．对照实验染色过程应设立对照实验

① 抗原对照；

② 抗血清对照：用正常兔血清代替免疫血清；

③ 灭活补体对照：将补体经56℃ 30分钟处理后，按补体同样比例稀释，与免疫血清等量混合后，进行补体法染色。

此法的荧光抗体不受免疫血清的动物种属限制，故一种荧光抗体的应用可更广泛，敏感性亦较间接法高，效价低的免疫血清亦可应用，故可节省免疫血清，尤其是在检查形态小的立克次体、病毒颗粒等或浓度较低的抗原时，使用此法甚为理想。