【交流】miRNA检测方法

microRNA（miRNA）是一种机体内源性表达的单链小分子RNA，位于基因组非编码区，本身不具有开放阅读框（open reading frame，ORF），具有高度保守性，时序性和组织特异性。miRNA广泛存在于各种真核细胞中，不编码任何蛋白质，长度仅为20～24nt。

成熟的miRNA 5′端有一个磷酸基团，3′端为羟基，由具有发夹状结构的约70～90nt的单链RNA前体经过Dicer酶加工后形成。成熟的miRNA形成RNA诱导的基因沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）作用于靶点mRNA，通过对mRNA剪切或抑制其翻译过程而调控基因的表达。

目前人们还不明确miRNA及其靶mRNA之间的作用机制。

最近有研究指出，miRNA在细胞生长、发育、分化、死亡等生物过程中起着重要的作用，同时，miRNA参与了血细胞生成、胰岛素分泌、神经系统构成和人类癌细胞生长等不同的过程，因此，非常有必要开发有效的实验工具来测定miRNA。

目前检测miRNA的方法主要有Northern印迹分析，微点阵（microarray）分析和实时定量PCR（quantitative Real-Time PCR）。下面将对这三种方法做简单的介绍及比较。

1、Northern印迹分析（Northern Analysis）

Northern印迹是基于杂交检测RNA的常用方法，它是最早用于miRNA分析的几种方法之一。这种方法简单易行，大部分实验室都可以进行操作，不需要额外的资金投入与设备更新。

不足之处：

1）Northern分析的过程涉及大量人工操作，并且每次仅有一条miRNA探针与一个RNA印迹杂交，因此，它适用于不适用于大规模的筛选实验。尽管如此，在简单探究miRNA功能机理的实验中，Northern印迹分析还是能够满足研究需要的。

2）Northern印迹分析的动态范围只能达到两个数量级，这就引发了一个严重的问题，进行实验的细胞内的miRNA分子的数量要达到比较大的范围，例如，能够检测40,000个miRNA分子每细胞的印迹条件实际上却不能准确检测10个miRNA分子每细胞。

另外，由于Northern印迹以杂交为原理，它通常不能有效区分具有细微序列差异的miRNA。例如，同一个家族中的miRNA let-7c与let-7a和let-7b之间仅有一个碱基的差异，导致Northern印迹分析无法清晰区分它们。此外，Northern印迹实验的重复性较弱。

3）Northern印迹耗时，耗量。进行一次miRNA检测需要3个工作日，不仅减慢了实验进程，也增加了杂交膜上信号扩散的风险。此外，Northern印迹大概需要5到10微克的总RNA量上样量才能成功检测出miRNA，增加了检测干细胞或人类初期肿瘤细胞这些稀少的样品的难度，甚至无法顺利开展实验。

2、微点阵（Microarray）分析

微点阵分析也是基于杂交的原理来检测miRNA，它通过测定特定过程中miRNA的表达水平，来分析了解miRNA的表达调控机制以及由miRNA调控的基因的表达。微点阵采用高密度的荧光标记探针与RNA样本杂交，通过荧光扫描获得表达图谱，借助相应软件进行miRNA的表达分析。

由于在设计探针时可以包含所有可用miRNA序列，因此微点阵可以作到高通量的miRNA分析。

不足之处：

1）微点阵仍然需要足够的RNA初始样本，大约为每个微点阵5微克。

2）由于微点阵以杂交为基础，因此同Northern印迹一样无法清楚的区分序列差异很小的miRNA。另外，微点阵也很难区分具有相同序列的前体miRNA和成熟的活性miRNA。

3、定量实时PCR（Quantitative Real-time PCR）

定量实时PCR技术通过扩增技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。起始目标核酸的拷贝数越高，就越快观察到荧光强度的显著增加。

定量实时PCR中TaqMan(fulengen)特异性分析依赖于两个PCR引物和一个序列特异的TaqMan探针的联合作用。这些荧光标记的探针利用Taq DNA聚合酶的5’核酸酶的活性，极大的提高了实时PCR的检测，从而使得对PCR后期加工中探针的降解分析的评估成为可能。

尽管定量实时PCR相比Northern分析和微点阵需要较少的样本，并且显著的提高了动态范围和敏感度，但是这种技术在检测miRNA时还是遇到了挑战。

由于成熟miRNA长度较短，难以设计成熟miRNA的有效的特异引物和探针，于是很多研究者对较长的前体miRNA分子进行定量实时PCR检测，利用前体miRNA的水平作为成熟的活性miRNA的替代标记。然而细胞内存在的前体miRNA的水平不能有效的指示相应的成熟miRNA水平，因此这种方法无法达到预想中的效果。

目前已有新的定量实时PCR的方法被用来解决检测miRNA中遇到的这些问题。这种新方法利用一种茎环（stem-loop）状引物进行miRNA的反转录，然后再进行定量实时PCR。

这个茎环状结构对成熟的miRNA 3′ 端具有特异性，能够将非常短的成熟miRNA分子扩展并且增加一个通用的3′ 引物位点进行实时PCR。这种茎环状结构也被认为可以形成一种空间的阻碍以防止对前体miRNA进行PCR引导。然后就可以利用实时PCR进行高特异性的定量检测miRNA的表达水平。这种实时PCR的优点是：

1）可以在起始样本量很小的情况下进行（RNA总量在1到10ng之间）。

2）动态范围达到了7个数量级，因此可以检测大量或者少量的miRNA。

3）这种方法可以区分只有一个碱基差别的miRNA。

4）和传统的定量实时PCR检测相比，在实验室中生产这些新的茎环状结构是很快并且很简单的。5)但也很多的不足之处，对于比较珍贵的标本，反转录一次，无法对其产物进行检测有很大的局限性。

下面的方法更为实用和经济，对于大范围的内寻找相关MIRAN更为有用

通过Poly A Polymerase 对miRNA 3’端进行加“Poly A”处理，同时利用M-MLV RTase 及独特的Oligo dT Adaptor 对Poly A 化的RNA 进行反转录，最后采用含有SYBR Green 的All-in-One TM Q-PCR Mix 对miRNA 进行特异性检测。

该试剂盒中包含有miRNA 检测所需要的所有试剂，客户仅需要提供RNA、miRNA 检测的上游引物及相关的仪器（如恒温仪、定量PCR 仪等）即可进行检测实验。

三种检测方法的比较

1. 检测简便、快捷、节约：miRNA qPCR Detection System是基于SYBR Green染料法的qPCR检测系统，可用于从一个合成反应的cDNA中检测多种miRNAs，不仅减少了误差、节约了样品，同时还实现了检测的高通

2. 检测的特异性：独特的miRNA引物设计技术及其优化的反应体系避免了非特异性扩增、特别是Pre-miRNA的污染

3.检测分辨率高：该系统能分辨单碱基差异的miRNA

4.一站式解决方案：公司不仅提供检测的试剂盒，还提供经验证的人源、小鼠源、大鼠源的特异性miRNA 检测引物。

5.检测灵敏度高：可在低至pg级的总RNA中检测到特异表达的miRNA

参考文献：

［1］Yingqing S, Seongjoon K, Neill W, et al.Development of a micro-array to detect human and mouse microRNAs and characterization of expression in human organs. Nucleic Acids Res,2004,32 (22): 2486～2494

［2］Caifu C, Kelly M, Ada H.W, et al. Real-time PCR:Advancing RNA Interference and MicroRNA Studies. Nucleic Acids Research, 2004,32,(22): e188