细胞培养的一些问题

1、液体培养基的保存是冷藏好？还是冷冻好？

要冷藏！因为液体培养基经冷冻后再经溶化时，其溶液的pH值会发生改变，溶液往往变碱，某些成分溶解也会受到影响对细胞生长不利。故液体培养基一定要存放在冷藏箱中，通常液体培养基在冷藏条件下可存放6个月～一年。

2、液体培养基中谷氨酰胺的作用，及使用方法

几乎所有的细胞对谷氨酰胺有较高的要求，细胞需要谷氨酰胺合成蛋白质，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。所以，各种培养液中都含有较大量的谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置-20 ◦C冰冻保存，用前加入培养基中。

加有谷氨酰胺的液体培养基4℃ 冰箱储存两周以上时，应重新加入原来量的谷氨酰胺。基础医学细胞中心在其服务项目中配制分装了高浓度（100倍）的谷氨酰胺溶液（1ml/支）。每支1ml的谷氨酰胺加到99ml完全培养基中，其终浓度为2mM/ml培养基。包装为粉红色，-24℃保存。

3、培养用液pH对细胞生长的影响

由于大多数细胞适宜pH为7.2～7.4，偏离此范围对细胞将产生有害的影响。各种细胞对pH的要求也不完全相同，原代培养细胞一般对pH变动耐受差，无限细胞系耐受力强。

但总体来说，细胞耐酸性比耐碱性强一些，偏酸环境中更利于细胞生长。因此，我们在配制培养用液时，可把液体的pH稍微调得偏酸一些。液体在经过0.10um或0.22um滤膜过滤时，溶液的pH还会向上浮动0.2左右。

4、常用培养基及培养用液的渗透压范围

培养基名称 渗透压范围（mOSM）

DMEM（高糖） 315～350

DMEM（低糖） 270 ～330

RPMI-1640 260～290

MEM-EBSS 280～310

MEM-NEAA 280～310

McCoy5a 280～310

MEM-a 280～310

M—199 275～305

IMDM 270～300

DMEM/F-12 280～310

F—10 270～300

F—12 275～300

培养基名称 渗透压范围（mOSM）

L—15 280～320

D-Hanks 280～300

Hanks 280～300

PBS 275～300

5、细胞传代消化时所用胰酶浓度越高越好吗？

不见得！因为胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、温度、胰酶浓度及溶液中是否含有Ca++， Mg++离子和血清等因素有关。通常情况下，pH 8.0， 温度37 ℃其作用能力最强。另外，钙、镁离子及血清均能大大降低其消化能力。

我们每次进行传代消化前，一定要用D-Hank's液或PBS液反复冲洗细胞培养瓶，以便于将含血清的培养基冲洗干净，这样就能大大提高消化液的消化能力。本中心通常使用的消化液浓度为：

（1）0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA。

（2）0.25%胰蛋白酶+0.03%EDTA。

（3）0.25%胰蛋白酶。

溶液pH8.0～9.0，使用D-Hank's液配制。

多数细胞传代消化可使用0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA这种消化液。

6、培养基在使用过程中应注意的问题：

（1）培养基在使用前需37℃预热或在室温平衡后再使用。

（2）细胞培养过程中，吸取过培养液的吸管不能再用火焰烧灼，防止残留在吸管内的培养基焦化，将有害物质带入培养液中。

（3）尽量缩短各种液体、细胞的暴露时间。

（4）避免液体间、细胞间的交叉污染。

（5）配制完全培养基时，配制的量最好在2周内用完为好。

7、血清的有关问题：

新生牛血清：新出生牛5天内取血制成

小牛血清：小牛出生16周以内采血制成。

胎牛血清：（进口血清）要求剖腹取胎制成。

国内厂家往往不能做到，经常把出生2天以内采血称为胎牛血清。

根据血清的生产工艺及血红蛋白、内毒素含量又分为：

（1）特级胎牛血清：40纳米过滤，内毒素含量≤10EU，

血红蛋白含量≤10mg/dl。

（2）优等胎牛血清：经过3次100纳米过滤，

内毒素含量≤25EU/ml，

血红蛋白含量≤25mg/ml。

（3）标准胎牛血清：3次100纳米过滤，低内毒素，低血红蛋白含量。

（4）活性碳/葡聚糖处理血清：激素含量大大降低。

（5）透析型胎牛血清：次黄嘌呤和胸腺核苷含量大大降低。

8、其他细胞培养用液：除培养基、血清、谷氨酰胺外，其他几种液体也属必须，不可省略。

（1）双抗：200倍，（1ml/支）其终浓度为青霉素100U/ml；链霉素100ug/ml，-24℃保存。

（2）L-谷氨酰胺：100倍，（1ml/支）， 终浓度2mM，-24℃保存。

（3）丙酮酸钠：配制浓度50mM，4ml/支，终浓度为1mM/ml，-24 ℃保存。

（4）Hepes液：配制浓度1M（5ml/支），一支Hepes加入到200ml完全培养基中，终浓度为25mM/ml，常温保存。

9、支原体污染及检测：

（1）支原体污染在细胞培养中最常见、不易被查觉，但支原体污染可显著影响细胞功能干扰实验结果。支原体是介于细菌和病毒之间的目前所知能独立生活的最小微生物，它无细胞壁，形态呈高度多形性，最小直径0.2um，可通过滤器。

目前中心通过对国内100余株/系细胞的检测，形势不容乐观。污染率达30%～60% 。课题组从国外引进细胞株/系也经常出现支原体的污染。支原体在污染细胞后，它通过影响细胞的DNA、RNA 的合成及急速消耗培养基中的氨基酸来抑制细胞的生长，并能降低细胞的融合率。因此，在运用各种细胞系进行实验研究时，首先要证明所用细胞有无支原体的污染。

（2）支原体污染后，培养基可不发生浑浊，细胞病变轻微或不明显，因此难以发现。目前，支原体检测的方法有以下几种。

（a）相差显微镜观察；

（b）.低张处理地衣红染色法；

（c）荧光染色法；

（d）.酶标法；

（e）PCR法：基础医学细胞中心使用该方法进行检测。

优点：灵敏度高，检测耗时短，样品量小（只需50ul细胞培养用液上清）。

缺点：引物及制剂费用较高。