细胞培养的一些问题

1、液体培养基的保存是冷藏好？还是冷冻好？

要冷藏！因为液体培养基经冷冻后再经溶化时，其溶液的pH值会发生改变，溶液往往变碱，某些成分溶解也会受到影响对细胞生长不利。故液体培养基一定要存放在冷藏箱中，通常液体培养基在冷藏条件下可存放6个月～一年。

2、液体培养基中谷氨酰胺的作用，及使用方法

几乎所有的细胞对谷氨酰胺有较高的要求，细胞需要谷氨酰胺合成蛋白质，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。所以，各种培养液中都含有较大量的谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置-20℃冰冻保存，用前加入培养基中。

加有谷氨酰胺的液体培养基4℃ 冰箱储存两周以上时，应重新加入原来量的谷氨酰胺。基础医学细胞中心在其服务项目中配制分装了高浓度（100倍）的谷氨酰胺溶液（1ml/支）。每支1ml的谷氨酰胺加到99ml完全培养基中，其终浓度为2mM/ml培养基。包装为粉红色，-24℃保存。

3、培养用液pH对细胞生长的影响

由于大多数细胞适宜pH为7.2～7.4，偏离此范围对细胞将产生有害的影响。各种细胞对pH的要求也不完全相同，原代培养细胞一般对pH变动耐受差，无限细胞系耐受力强。

但总体来说，细胞耐酸性比耐碱性强一些，偏酸环境中更利于细胞生长。因此，我们在配制培养用液时，可把液体的pH稍微调得偏酸一些。液体在经过0.10um或0.22um滤膜过滤时，溶液的pH还会向上浮动0.2左右。

4、常用培养基及培养用液的渗透压范围

培养基名称 渗透压范围（mOSM）

DMEM（高糖） 315～350

DMEM（低糖） 270 ～330

RPMI-1640 260～290

MEM-EBSS 280～310

MEM-NEAA 280～310

McCoy5a 280～310

MEM-a 280～310

M—199 275～305

IMDM 270～300

DMEM/F-12 280～310

F—10 270～300

F—12 275～300

培养基名称 渗透压范围（mOSM）

L—15 280～320

D-Hanks 280～300

Hanks 280～300

PBS 275～300

5、细胞传代消化时所用胰酶浓度越高越好吗？

不见得！因为胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、温度、胰酶浓度及溶液中是否含有Ca++， Mg++离子和血清等因素有关。通常情况下，pH 8.0， 温度37 ℃其作用能力最强。另外，钙、镁离子及血清均能大大降低其消化能力。

我们每次进行传代消化前，一定要用D-Hank's液或PBS液反复冲洗细胞培养瓶，以便于将含血清的培养基冲洗干净，这样就能大大提高消化液的消化能力。本中心通常使用的消化液浓度为：

（1）0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA。

（2）0.25%胰蛋白酶+0.03%EDTA。

（3）0.25%胰蛋白酶。

溶液pH8.0～9.0，使用D-Hank's液配制。

多数细胞传代消化可使用0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA这种消化液。