【心得】RT PCR的△△ct法的原理和一个简单的excel处理表

△△Ct法的推导过程

PCR指数扩增公式是：

Xn = X0 * ( 1 + Ex )n [1]

式中，Xn是第 n 个循环后目标分子数，Xo 是初始目标分子数，Ex是目标分子扩增效率，n 是循环数。用Ct 代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数，因此：

Xt = X0 * ( 1 + Ex )Ctx [2]

式中，Xt 是目标分子X达到设定的阈值时的分子数，是一个常数。Ctx 是目标分子X扩增达到阈值时（即达到规定的拷贝数时）的循环数。

对于看家基因的PCR反应，也有同样的公式：

Rt = R0 * ( 1 + ER)CtR [3]

式中，ER是看家基因R扩增效率。Rt是看家基因R达到设定的阈值时的分子数，对于使用 Taqman探针的实时扩增而言， Xt和 Rt的值由一系列因素决定：包括探针所带的荧光报导基团、探针序列对探针荧光特性的影响、探针的水解效率和纯度以及荧光阈值的设定。因此Rt 并不一定等于Xt。

假设目标序列与看家基因扩增效率相同，EX = ER= E，用目标分子数（常数）除以看家基因分子数（常数），即目标分子与看家基因的表达量比值K ，K是一个常数

K = Xt / Rt = [X0 * ( 1 + E )Ctx ] / [R0 * ( 1 + E)CtR ] = （ X0 / R0 ）_~A_1_~D_E_~B_Ctx~F_CtR_~P4~Q~K~Hp~M~Kp~M将Ctx- CtR 称为 △Ct ，（ X0 / R0 ）称为 XN（初始目标序列与看家基因的分子数比值，其意义是经过通过内参校正之后的初始目标分子数），整理上式得：

XN = K * ( 1 + E) -△Ct [5]

最后用任一样本q 的XN除以参照因子（calibrator，cb）（参照因子可以是正常对照也可以是相对对照）的XN得到：

XN,q/ XN, cb = [ K * ( 1 + E ) -△Ctq ] /[ K * ( 1 + E ) -△Ct,cb ] = ( 1 + E ) –(△Ctq - △Ct,cb ) [6]

于是将△Ctq - △Ct,cb称为 △△Ct ，这种数据分析方法称为△△Ct法。

对于一个少于150bp 的扩增片断而言，如果Mg2+ 浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率E接近于1 。因此目标序列的数目通过内参校正之后相对于参照因子而言就是

初始目标基因数/ 初始参比因子数XN,q/ XN,cb = 2 - △△Ct

整理式 [5] 得，XN / K = 2 - △Ct

常数K = Xt / Rt， 在K≠1时，即达到阈值时，目标基因数≠ 看家基因数，其意义是消除实验处理造成的目标基因数≠ 看家基因数的因素后，初始目标基因数/初始看家基因数；当 K =1时， XN = 2 - △Ct 。

本文来自： KennethJ. Livaundefined and Thomas D. Schmittgen..Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCRand the 2－△△CT Method. METHODS 25,402–408 (2001)。
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本文来自楚天生物技术支持。请尊重作者劳动成果。