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病毒RNA提取实验方法(protocol)

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一、用异硫氰酸胍提取

提禽流感病毒的详细步骤,可参考(我提过N次做定量PCR都没问题):

1.取200ul样品数+阴性对照+阳性对照个1.5ml灭菌eppendorf管。

2.加600ul异硫氰酸胍,然后加入对照和样品,再加200ul氯仿,颠倒混匀。

3.13000rpm离心15min。

4.在第3步离心快结束时,另取同样多eppendorf管,加入400ul -20度预冷的异丙醇。

5.取第3步离心的上清(一定不要吸取到中间白色层,第3步离心结束往外拿的时候,管子尽量不要倾斜)转移到第4步准备的管中,颠倒混匀。

6.13000rpm离心15min,轻轻倒去上清;在吸水纸上尽量沾干液体。

7.加600ul 75%乙醇,颠倒数次以洗涤残存异丙醇。

7.13000rpm离心15min,轻轻倒去上清;在吸水纸上尽量沾干液体。

8.4000rpm离心10sec,将管壁残存液体甩到底部,用微量枪头吸干,室温干燥2-3min(不可过分干燥,防止下一步RNA 不溶解)。

9.加入20ul DEPE水(加入depc的纯水高压后的水即为DEPE水),轻轻混匀溶解RNA 。2000rpm离心5sec,冰上保存备用(最好2小时内使用,以免RNA 降解)。

二、用TRIzol LS提取

应用TRIzol LS提取病毒RNA 。

所提取物为血清、血液、细胞培养液、鸡胚尿囊液等液体中的病毒。提取时尽量在人少时进行,防止空气中RNA 酶的污染。所用一切物品也应是无RNA 酶的。

1.1 在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液500ul,再加入TRIzol LS 500ul,充分混匀,室温放置10min。

1.2 加入200ul的氯仿,盖紧离心管盖,用力震荡离心管(溶液充分乳化,成乳白状,无分相现象),室温放置10min (由于氯仿沸点低、易挥发,振荡时离心管可能爆开,小心)。

1.3 离心 4℃、13000r/min、15min,取上层液相移入另一管(切忌吸动白色中间相)。

1.4 加入等体积异丙醇,轻轻颠倒离心管充分混匀液体,室温放置10min。

1.5 离心 4℃、13000r/min、15min,(这时乍一看会发现管子里好像没有东西,再仔细看看,会发现靠近管底的壁上有一星点的白色沉淀物,就是它了)用枪小心吸去所有上清。

1.6 1ml75%乙醇洗一遍,离心 4℃、8000r/min、10min,(这时又会发现管子没东西了,不要担心,有的,但是因为量太少看不见罢了)用枪小心吸去所有上清,在超净台中干燥5min。

1.7 加入适量DEPC处理水。(如果材料来源丰富的话,加入的水量为下一步RT的total减去其他试剂的量;若要省着点用,则自己看着办了,尽量不要加太多的水)。

1.8 建议立即做RT。若要保存,可在上一步加入乙醇后冻存于-70℃,可保存一年;若加入DEPC水后则只能在-20℃保存1个月左右。

三、Trizol法提禽流感病毒protocol

Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌,样品量从几十毫克至几克。

1、取鸡胚尿囊液,加入5-10倍体积 Trizol液,混匀;

2、室温放置5分钟,然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒;

3、取上层水相于一新的离心管,按每ml Trizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,12000g离心10分钟;

4、弃去上清液,按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,混匀,4℃下7500g离心5分钟;

5、重复第4步;

6、小心弃去上清液,然后室温干燥5-10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA 的溶解度;

7、然后将RNA 溶于水中,放置10分钟。

[注意]

1、整个操作要带口罩及一次性手套,并尽可能在低温下操作。

2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上,RNA 沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周,-20℃保存一年。

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