轮状病毒纯化以及ELISA检测

轮状病毒（rotavirus，RV）纯化方法，仅供参考

方法一

氯化铯密度梯度离心纯化法（用密度梯度来做，首先我们需要什么样的转头，角式的，或者是甩平转头，一般用甩平转头。在准备密度梯度时，对病毒的浮力密度要清楚是多少，具体数字，然后我们才能知道用多大浓度的梯度介质。）

1、病毒浓缩

（1）PEG沉淀病毒：在收集到的病毒上清加入终浓度5％的PEG6000, 4℃搅拌过夜，10,000rpm, 4℃, 1.5小时离心，弃上清，用TNMC缓冲液(50mM Tris-Hcl pH7.5, 100mM Nacl, 10mM Cacl2,1mM Mgcl2 )悬浮沉淀；

（2）三氟三氯乙烷抽提：取PEG浓缩的病毒液，加入等体积的三氟三氯乙烷（三氟三氯乙烷是有机溶剂，可以去除许多细胞中的杂质（如脂类），同时因为rotavirus没有包膜，所以能抵抗三氟三氯乙烷。）抽提一次，12,000rpm, 4℃，10min，离心，收集水相,TNMC缓冲液10倍稀释后，50,000rpm, 4℃, 1小时离心，沉淀用TNMC缓冲液悬浮。

2、CsCl密度梯度离心

取病毒液，与CsCl制成56％的乳化液，装入5ml梯度离心管中，水平转头50,000rpm, 4℃, 22小时超速离心。得三条乳白色的条带。分别收集离心所得的条带，用TNMC缓冲液稀释10－15倍，50,000rpm, 4℃, 1.5小时，离心去除CsCl，得到分离后较纯的病毒。

方法二

蔗糖密度梯度离心：

1、配制60%、45%、30%、15%的蔗糖（蔗糖M/水V），还有60%、50%、40%、30%、15%的蔗糖溶液也可以。加热溶解之后，0.22UM滤器过滤，4度保存备用，注意：一定要配的准确。

2、蔗糖密度梯度离心管，大和小两种。

3、小管离心管，每种蔗糖溶液加2~2.5ml，依据你的病毒液体有多少。先加密度小的蔗糖溶液，在加密度大的，依次类推，加的时候要温柔呵呵！用于加蔗糖梯度的注射器用干净\高压的玻璃注射器(2.5ML), 一次性塑料注射器密封性不好和注射器芯容易变形, 加蔗糖和样品不准，针头是比较长的,至少有10CM长,具体打电话问下试剂公司.

4、加蔗糖溶液有专门的针头，比蔗糖离心管长。

5、要做这个试验的时候，提前把离心管洗干净。

方法三

Preparation of Virions Containing Uncleaved VP4

1、Infect MA104 cells at a high MOI(3–10PFU/cell)with trypsin-activated virus.

2、Wash the cell sheet several times with serum-free medium following adsorption.

3、Maintain the cells in trypsin-free medium containing 1μg/mL aprotinin or 0.5μg/mL leupeptin.

4、Harvest the cells once the CPE has reached 70–80% (24 h post infection).

Purification of Triple-Layered Virions

1、Combine the lysate with an equal volume of trichlorotrifluoroethane, and homogenize the mixture with a Sorvall Omni-mixer for three 1min cycles on ice.

2、Centrifuge the homogenates at low speed to separate the organic and aqueous phases (4100g for 10 min in a Sorvall GSA rotor at 4°C).

3、Pellet the virus particles from the aqueous phase by centrifugation at 90,000g in a Beckman (Palo Alto, CA) SW28 rotor or at 45,000g in a Beckman Type 19 rotor for 2h at 4°C.

4、Resuspend the pellet in TBS, and add CsCl to the virus suspension to achieve a density of 1.370g/cm3, as determined by refractometry (see Note 7).

5、Centrifuge the mixture at 110,000g in a Beckman SW50.1 rotor for 20h at 4°C.

6、Inspect the gradients in a darkened room with an inverted light source, to reveal two bands.

7、Recover the virus from the gradient by puncturing the bottom of the centrifuge tube with a 21-gage needle, and collect drops containing TLPs and DLPs, respectively,into separate tubes.

8、Remove the CsCl by dialyzing the virus extensively against TBS at 4°C.

9、Store the dialyzed samples at 4°C in the presence of 0.01% NaN3.

Tris-buffered saline(TBS): 8g NaCl, 0.38g KCl, 0.1g Na2HPO4, 1g dextrose,3g Tris-base, 0.1g MgCl2, 0.1g CaCl2. Dissolve in distilled H2O, adjust to pH 7.4 with HCl, and make up to 1L.

用完整的病毒作为抗原，做ELISA试剂的最低层，不需要纯化病毒。只需包被RV作检测抗体之用，这是间接法ELISA。细胞培养的病毒用包被缓冲液做1:40稀释（病变出的好，这个稀释度就跑不了，我们实验室做了若干年了），每孔100ul,过夜成了。

如果不放心，可以高速离心后再过G200柱，这个方法比超离方便多了。病毒从凝胶空隙最早流出，而杂蛋白进入孔内出来的缓慢。ELISA不需要太纯的病毒。不知道是SA11还是Wa株？前者病变非常典型，后者病变缓慢，如果不放心1：40稀释，可以用有限稀释方法滴定抗原用量。