简介
采用新生乳鼠进行轮状病毒感染， 经济实用， 可操作性强， 临床病理特征明显， 容易观察。3～5 日龄乳鼠经口接种感染轮状病毒后可有效诱导腹泻， 出现明显腹泻， 体重增长迟缓， 较长的排毒时间， 同时小肠组织出现固有层充血， 淋巴细胞浸润、肠绒毛萎缩等病理改变； 电镜显示细胞内出现大量空泡， 细胞核固缩，线粒体肿胀， 间质水肿， 小肠组织电镜可检测到轮状病毒颗粒。
原理
轮状病毒腹泻机制复杂， 尚不明确。可能的机制包括肠黏膜损害引起吸收不良， 病毒毒素作用， 肠神经系统 （enteric nervoussystem ， ENS） 受到刺激、绒毛缺血。 多种细胞因子参与作用等均参与了轮状病毒腹泻的发病机制。
用途
广泛应用于观察 Hp 感染的致病过程、探讨致病机制、验证致病因子、研究传播途径、筛选新药。在疫苗研制中用于筛选保护性抗原、无毒免疫佐剂以及探讨免疫方法、免疫机制等。
材料与仪器
器材：猪和犬
试剂：Hp 菌液 （106－109 CFU/0.2 ml）
步骤
轮状病毒感染动物模型的基本过程可分为如下几步：
A. 病毒培养：选择猴肾 MA104 细胞 （非洲绿猴胎肾细胞传代细胞系） 细胞生长于含 10％ 新生牛血清的高糖培养基 （IDMEM）。细胞成单层后用 Hanks 液洗涤 3 次， 然后加人经 10 U/ml 胰蛋白酶预处理的轮状病毒 SA11，37 ℃ 吸附 60 分钟， 弃上清液， 加含 1 U/ml 的胰蛋白酶， 继而在无牛血清的 DMEM 液静止培养 （37 ℃，59％ CO）。 待细胞病变明显后收取细胞培养物。
B. 病毒浓缩：
方法一， 细胞培养物经 3 次冻融，4 ℃ 3000 xg 离心 30 分钟， 弃沉淀， 取上清液分装，100000 xg 离心 3 小时， 沉淀加磷酸盐缓冲液 （PBS），－70 ℃ 冻存备用。采用空斑形成法滴定病毒的感染滴度， 待病毒滴度达到 10' 空斑形成单位 （plaque forming unit ， PFUYml 时进行动物实验。
方法二、MA104 细胞感染 48 小时后， 收集细胞和上清， 反复冻融 3 次后， 超滤浓缩病毒， 取 10＇PFU 病毒经口感染动物。
C. 病毒感染：选择清洁级健康孕鼠， 检测其轮状病毒抗原为阴性， 待孕鼠自然分娩后， 自然母乳喂养， 第 4 天用改良的 1 ml 注射器经口灌服 5x10＇PFU 猴轮状病毒 SA11 病毒悬液， 以后正常喂养。
D. 临床观察及动物粪便样品收集： 乳鼠感染 SA11 后， 对其进行连续的临床观察， 收集乳鼠粪便样本。每隔 12 小时观察 1 次， 每次用手指轻轻按摩乳鼠腹部， 观察腹泻产生情况， 腹泻的判断参照文献分为 6 级，1 级为无便。2 级为黄色成形便，3 级为黄色糊状便，4 级为黄色水样黏液便，5 级为黄色蛋汤样便，6 级为完全黄色水样便。3 级 （黄色糊状便） 及以上为腹泻，4～5 级为轻度腹泻，6 级为重度腹泻。腹泻的判断由同一人完成。
E. RV 抗原检测： 取适量粪便样品放人容器内， 加入 9 倍体积等渗盐水， 搅拌混匀 2 分钟， 静置或离心后， 用 A 群轮状病毒诊断试剂盒检测。
F. 小肠组织光镜及电镜观察： 分别在病毒攻击后的第 4 天用颈椎脱臼法随机处死每小组 2 只乳鼠。 剪取空肠段约 1 cm 制作样本， 作病理组织学诊断和透射电子显微镜下观察并拍照。
G. 小肠绒毛高度测量： 每小组各取 2 只乳鼠， 每只取空肠石蜡切片 4 张， 共 8 张。苏木素Ⅰ伊红 （HE） 染色后， 光学显微镜下照相， 专业图像分析软件测量其中所有绒毛高度， 测量参照长度为血细胞计数板计数池标记线。
来源：丁香实验
