胶体金免疫层析分析( GICA)的制作及操作中的问题

相关专题

免疫胶体金技术专题

随着免疫 分析日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业(diagnostic industry)，免疫分析向两个方向发展：一类为全自动化的免疫分析;另一类为以硝酸纤维膜为载体的快速免疫分析。

前者需要价格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各种试剂盒，目前只能在医疗及检测中心应用，虽也能较快速给出结果，但仍需一定时间，不适合远离医疗及检测中心的地区，更不能用于“患者床旁检验”(real time clinical decision)和普查的需要，在酶免疫分析的基础上，主要以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断方法迅速和广泛地发展起来。

这类方法目前在文献及市场上的命名还很不统一。它实际上属于快速斑点免疫结合分析(dot immunobinding assay, DIBA)，始于80年代。现介绍如下：

一、两种模式

1、班点免疫渗滤分析(dot immunofiltrtion assay, DIFA) 免疫反应是通过垂直穿透固定有配体的硝酸纤维素膜而进行的(flow through type)。

2、斑点免疫层析分析(dot immunochro-matography assay ，DICA) 分析原理与DIFA相同，只是反应液体的流动不是直向的穿透流动，而是层析作用的横向流动(lateral flow type)，在1990年开始应用。

两种类型快速免疫分析比较见表。

表 免疫渗滤分析和免疫层析分析的比较

	免疫渗滤分析（穿透滤过型）	免疫层析分析（横向流动型）
硝酸纤维素膜的种类及形式组成方式	为圆片膜，孔径0.2-0.4µm较简单，由载有配体(抗体或抗原 )的硝酸纤维素膜片及底层的吸水垫料组成	为窄长型膜，依灵敏度及流速的要求，选用孔径不同的合适的膜。自下端至上端(由左至右)由:（1）样品垫(sample pad) （2）载有固相标记配体(抗体或抗原)的玻璃纤维素膜条或聚酯膜条(conjugate release membrane) （3）合适孔径的硝酸纤维素膜条(喷涂有显示阳性结果的捕捉分析物的配体线，和阴性对照组线)(ni-troCell ulose memtrane)4.吸水垫(absorbent pad)等四部分衔接固定在不干扰免疫反应和流速的簿塑料背板上(back sheet)
标记配体的形式	为液相形式	根据需要及可能可设计同时 大多数为固相形式
多功能性	测定一种以上分析物加样、洗涤、加标记	同左
操作步骤	配体及洗涤等步骤	大多数只有加样一个步骤

注: 以上标记配体均为胶体金或硒标记、分散型染料标记等。如为酶标记则二者都必须增加“加显色底物”的步骤

二、标记物的种类

标记物包括、胶体金属(胶体金，胶体硒)、分散型染料(disperse dyes)和染料标记的微球(latex particles)等，标记物各有优缺点，可根据以下的标准选择，如：灵敏度，所需要的颜色，分析的模式和操作步骤，制备、保证重复性、急定性及规模及的难易程度和重复性，以及标记物所需配体量等。

其中酶虽然有高灵敏度，重复性好及标记物易规模化等优点，但它需要洗涤，加底物等步骤，需要反应的时间也长些，对技术也有一些要求，故未能作为快速诊断的主要标记物(1985年最初的免疫渗滤分析是以酶作为标记物)。

目前应用最广泛的标记物为胶体金，包括：胶体金免疫渗滤分析(gold immumofiltraition assay GIFA)或滴金免疫分析和胶体金免疫层析分析(gold immunochromatography assay ， GICA)。由于GICA更简便快速，已成为目前最主要的快速免疫分析方法之一。

三、原理

胶体金免疫渗滤分析(GIFA)原理与操作步骤基本与ELISA相同：加样品于固定有配体(抗体或抗原，此处以抗体为例，下同)的硝酸纤维素膜上，通过渗滤在膜中形成抗体-抗原复合物，洗涤渗滤后，再加液体的胶体金标记抗体。

当结果为阳性时，在膜上固定有抗体-抗原-胶体金标记抗体复合物而呈现红色斑点。胶体金免疫层析分析CICA原理与GIFA相同，只是操作步骤有所不同，如反应液体流动方向由垂直渗滤改为横向层析流动(见表)：样品加样品垫(1)上，样品向吸水垫(4)方向流动，途径载有固相胶体金标记抗体膜(2)后，将金标记物完全复溶，抗原与金标记抗体形成金标记抗体-抗原复合物，继续向前流动至硝酸纤维素膜条(3)上，固定有捕捉抗原的抗体线处。

当结果为阳性时，金标记抗体-抗原复合物上，就会形成金标记抗体-抗原-固相抗体复合物，呈现红色阳性条带;如样品中无抗原，则不被捕获，就不显色，则结果为阴性。

多余的游离金标记抗体继续前移至固定有抗金标记体二抗处，被固定呈现红色的阴性对照。GICA与GIFA不同之处在于后者只是单一的免疫层析条，不需要其它试剂，一步操作。二者与ELISA不同处是反应时间大大缩短，仅需要数分钟就完成了ELISA需数小时才能显示的结果。

因为在GIFA和GICA中，高浓度的抗体集中固定在纤维素的微孔中，待测抗原在渗滤或层析时，流经微孔与固定的高浓度抗体紧密接触，很快完成免疫结合反应。这就是以膜为基础的胶体金快速免疫结合分析中的免疫浓缩作用(immunoconcentraiton)。

在ELISA中，待测抗原要在液相中经过扩散作用，逐渐与吸附在固相表面的抗体结合。同时，标记抗体也需要同样的扩散结合过程形成抗体-抗原-标记抗体复合物，故需时间较长。

四、胶体金块快速免疫结合分析的应用

应用领域很广，可分为临床应用与非临床应用两类。目前应用多以前者为主。

1、临床应用 已应用于临床的很多领域。由于目前它还是定性分析，故主要用以检测正常体认中不存在的生物活性物质(如传染病的抗原及抗体)，以及正常情况下体液中含量很低而在某些疾病中升高的生物活性物质。随着技术的进展，对某些可确定诊断的、有正常上限值(cutoff)的生物活性物质也可进行检测。下面列出国内外已应用的项目。

(1)传染病 ：

①各种病毒的相应抗原及抗体：各种病毒性肝炎、巨细胞病毒抗体，单纯疱疹病毒抗体，风疹病毒抗体，肾综合症出血热抗体，登革热病毒抗体及轮状病毒等;

②性病：爱滋病病毒抗体，梅青螺旋体抗体，淋球菌及泌尿生殖系统的衣原体等;

③细菌：结核杆菌抗体，A族乙型溶血链球菌、沙门氏菌、幽门螺旋杆菌抗体等;

④寄生虫：疟原虫，血吸虫抗体，包囊虫抗体，弓形虫抗体等。

(2)激素 目前用于生殖标志物，主要有诊断早早孕的人绒毛膜促性腺激素(HCG)和检测排卵的促黄体生成素(LH)和促卵泡激素(FSH)等。

(3)心血管病 急性心肌梗死的标志物，包括肌酸激酶的同工酶CK-MB，肌红蛋白，肌钙蛋白-T及脂肪酸结合蛋白质(PABP)等。还有与心血管疾病有重要关系的D-二聚体(D-dimer)的检测。

(4)肿瘤 包括对肿瘤进行筛查和早期诊断有意义的肿瘤标志物，如前列腺特异抗原(PSA)，AFP，CEA，CA125及CA15-3，以及对肠道肿瘤筛查有重要意义的大便潜血免疫检测(FOB)等。

(5)自家免疫病 抗双链DNA抗体和诊断甲状腺自家免疫病的甲状腺过氧化物酶(TPO)抗体。

(6) 毒品 检测尿液中的可卡因、大麻、吗啡、海洛因、苯丙胺等。国外报道有可同时测7种毒品的GICA.

(7)其它 检测C-反应蛋白，半定量检测血清α-脂蛋白。

2、非临床应用 可用于食品检测，环境污染，生物沾染，还可用于生物战剂的快速检测，兽医学及法医学等方面检测。

五、制作及操作中需注意的问题

以GICA为例，它将几种组分优化组合成一个整体的免疫层析分析条，许多条件及条件的组合都会影响到它的质量，包括：

(1)硝酸纤维素膜的性能和质量，膜孔径大小及均一性，选定膜孔径的适宜性，结合配体(抗原或抗体)容量的大小，非特异吸附性能，亲水性及液体的流动性和流动速度的均一性等;

(2)捕捉配体的量及质量(配体的纯度，亲和力及滴度)及在膜上配体的包被量和均一性。配体划线位置的固定一致性;

(3)固相金标记膜中的胶体金和配体的含量和比度，条间的均一性，固相标记物的稳定性，复溶性，复溶速度及流动性，所含缓冲物质的种类及有效促溶剂的使用等;

(4)各种膜，甚至包括样品垫是否经过预期处理以减少非特异吸附。

以上条件都可以综合影响胶体免疫层析的质量控制，主要包括：灵敏度，阴阳性界限值(cutoff)的准确性和一致性及层析条间的重复性等。

(1)灵敏度：因测定主要针对正常人体液中不存在或含量很低的生物活性物质的定性结果。高灵敏度及其重复性是最重要的质量控制指标。为此，生产厂家在保证分析条的各种优化条件外，还应提供能确证灵敏度的标准品，供操作者检验其灵敏度和重复性。另外，还应配有相应的阳性及阴性对照血清以供对照之用。

(2)阴阳性界限值的准确性和重复性：避免发生假阴性人假阳性结果，保证结果的正确。生产厂家应提供确定界限值的标准品，最好还要提供低于或高于界限值的标准品(注明浓度)，以供使用者对结果的判断。

六、应用的重点和展望

临床应用的重点应放在：

(1)急需快速诊断以便进行治疗的急重症，如协助确诊急性心肌梗死的急性心梗标志物就是很好的例子。有普查意义的检查和流行病学调查：如各种传染病(病毒性肝炎，艾滋病，性病及其它各种流行病)流行病调查;某些肿瘤(如前列腺癌，结肠癌，肝癌，乳腺癌)的普查及预防检查;围产期的健康普查等。

它可以作为快速的初筛普查手段，对阳性和可疑的结果再进一步做更细的可靠的检查。

今后的发展：

(1)全面提高质量。突出质量控制的保证，为进一步发展打好基础。

(2)提高检测的灵敏度。目前检测的灵敏度都低于相应的定量免疫分析，应尽量缩小差距。

除使用各种优质的原料，如膜条，高纯度高亲和力的配体(特别是配伍好的优质单抗)，优质高比度的标记配体以及先进的工艺外，还应引进信号放大系统，例如生物素-链亲和素系统，用链亲和素作为膜上的捕捉配体，分别用生物素化和胶体金标记的配伍良好的优质的特异性单抗与分析物形成免疫复合物。

应用链亲和素与生物素结合的四价性及极高的亲和常数，可明显提高灵敏度。此外，链亲和素-生物素系统还可以作为一种通用的分析系统，检测不同的抗原。由于链亲和素价格较贵，也可用高质量的抗生物素抗体作为通用的检测系统。

(3)实现半定量和定量化。

①可通过精确控制膜上捕捉配体的量，使用多条平行捕捉配体线的方法，通过显色条带的数目，判断分析物的浓度区间，得到半定量的结果;

②应用反射的光密度计测量显色带或斑点的颜色强度，换算成浓度值，实现定量的估算。德国宝灵曼生产的肌钙蛋白-T及相应的测量仪(strip reader)即可显示出免疫层析条上肌触目惊心蛋白-T的量。香港研制的FABP胶体金免疫渗滤分析也配有定量分析仪，可进行定量测定。二者均成为患者床旁诊断急性心肌梗死的快速灵敏方法。

(4)检测多种分析物。同一个膜上可同时测定几种有相关意义的分析物，如乙型肝炎不同的抗原及抗体。国外已有同时测几种心梗标志物及测定多种毒品的胶体金免疫分析。

(5)建立检测全血的方法。主要针对急重症快速诊断之用，以减少分离血清的音间。德国宝灵曼生产的人肌钙蛋白GICA便采用全血检测方法。检测全血的方法对自检，患者床旁检查和边远地区的普查都有实际应用意义。