核酸的定量测定——定磷法

核酸的定量测定——定磷法

[原理]

磷的测定方法很多，Fiske-Subbarow定磷法是一经典的但至今仍被经常采用的方法，它具有灵敏、简便的特点。各种含磷有机物经硫酸或过氯酸水解，使有机磷消化成为无机磷。无机磷在酸性条件下，与钼酸盐（常用钼酸铵或钼酸钠）反应生成磷钼酸盐络合物。

用还原剂处理，磷钼酸盐络合物被还原生成钼蓝，在660nm处有最大光吸收峰。在一定浓度范围内，颜色的深浅与磷含量成正比关系。因此可应用分光光度法进行磷的定量测定。

化学反应式：

(NH 4 ) 2 MoO 4 + H 2 SO 4 → H 2 MoO 4 + (NH 4 ) 2 SO 4

H 3 PO 4 + 12H 2 MoO 4 → H 3 P (Mo 3 O 10 ) 4 + 12H 2 O

还原剂

H 3 P (Mo 3 O 10 ) 4 → Mo 2 O 3 MoO 3

核酸是一类含磷化合物，其分子含有一定比例的磷，一般纯的RNA及其核苷酸含磷质量分数为9.0%；DNA及其核苷酸含磷质量分数为9.2%，即每100g核酸含有9.0～9.2g磷，也就是核酸量是含磷量的11倍左右，故测得磷的量，即可求得核酸量。这就是定磷法的理论依据，磷的定量测定是测定核酸含量常用手段之一。

生物有机磷材料中有时含有无机磷杂质，故用定磷法来测定该有机磷物质的量时，必须分别测定该样品的总磷量，即样品经过消化以后所测得的含磷量，以及该样品的无机磷含量，即样品未经消化直接测得的含磷量。将总磷量减去无机磷才是该有机磷物质的含磷量。

[方法和步骤]

1、 磷标准曲线的绘制

取试管7支，0～6依次编号。按下表加入各 试剂 。注意每加好一种 试剂 后应立即摇匀。

管号 名称	0	1	2	3	4	5	6
标准磷溶液/mL	0	0.5	1.0	1.5	2.0	2.5	3.0
6 mol/L 硫酸/mL	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
25g/L钼酸铵/mL	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
还原剂/mL	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
蒸馏水/mL	3.9	3.4	2.9	2.4	1.9	1.4	0.9

各反应液加毕后，于30℃保温20min，置分光光度计中在波长660nm比色，测光吸收值。以磷含量为横坐标，光吸收值为纵坐标作图，即得定磷标准曲线。

2、总磷量的测定

取30毫升凯氏烧瓶2只，Ⅰ、Ⅱ依次编号，Ⅰ号瓶为空白对照，用刻度吸管准确吸取核糖核酸样液1.0mL，置于Ⅱ号凯氏烧瓶内，Ⅰ号瓶加入蒸馏水1.0mL，不加样液，两瓶分别加入6mol/L硫酸1.0mL置消化架用小火加热消化，待溶液呈褐色，稍加冷却，加入2 mol/L硝酸2滴，再继续加热，直至逸出白色烟雾，溶液无色透明，表示消化完成时为止。

待凯氏烧瓶冷却后，分别加入1.0mL蒸馏水，置沸水浴蒸煮5min，使焦磷酸分解。凯氏烧瓶从沸水浴中取出，待其冷却，将Ⅰ和Ⅱ号瓶内的消化液分别移入两只10毫升容量瓶中，用少量蒸馏水洗涤凯氏烧瓶两次，并将洗涤液一并倒入容量瓶内，再各加蒸馏水稀释至刻度。

取试管3支，按7～9依次编号，7号管为空白对照。

准确吸取空白对照液1.0mL，置于7号管内，再分别准确吸取Ⅱ号瓶经过消化的核糖核酸样液1.0mL，置于8、9号管内，以下操作与磷标准曲线绘制相同。测出光密度，即可由绘制的标准曲线查得核糖核酸经消化稀释后的总磷量。

3、无机磷的测定

取试管3支，按10～12依次编号，10号管为空白对照。

用刻度吸管分别准确吸取未经消化的核糖核酸液1.0mL，作为无机磷测定样液，置于11、12号管内，空白管以蒸馏水代替RNA液，以下操作与磷标准曲线绘制相同。测出光密度，即可由绘制的标准曲线查得无机磷含量。若溶液浑浊，影响测定光密度，可在加入试剂摇匀后，进行过滤或置 离心机 3 000r/min离心15min，取其上清液再测定。

4、有机磷的测定

按上述方法分别测得总磷和无机磷的光密度，自总磷的光密度扣除无机磷的光密度，即为消化稀释后样液有机磷的光密度。

再由磷标准曲线查得有机磷含量。

[计算结果]

计算样品中核酸的含量。