一种基于手动芯片点样仪的快捷高效的转基因植物PCR-dot-blot鉴定法
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当前检测转基因植物的权威方法是分子杂交，其中Southern、Northern、Western杂交分别从整合、转录、翻译水平检测外源基因的行为，虽然说服力强，但是操作繁琐，费用较高，只适用于随机取样检测。如果用于批量检测，传统做法将会进一步显露出效率偏低、重复性差等缺点。
为建立高速度、高通量的检测方法，近年来发展了生物芯片技术，即将大量DNA或蛋白质等以预先设计的方式固定在载体上形成高密度阵列，利用核酸分子杂交、蛋白分子亲和原理对样品进行批量检测。该技术以其高效、快速的优势，有力地推动了后基类组时代医学及分子生物学各个领域的研究工作。
随着该项技术的普及，许多研究者希望能够用更简单的设备方便地制备个性化的芯片，以便更加灵活地为科研服务。
手动芯片点样仪（manua microarrayer）可以很好地满足这一需求，这类产品价格实惠、操作简单、重复性好，可以用来制作高质量的基因或蛋白芯片并且已经得到许多成功的结果，但在鉴定转基因植物方面尚未见报道。
本论文报道了一种基于手动芯片点样仪的快速、批量鉴定转基因植物的PCR-dot-blot新方法，旨在提高操作效率和可重复性。
首先对转基因烟草用外源目的基因特异性引物进行常规PCR鉴定，然后将该PCR产物回收纯化除去引物后，将仅为6nl的PCR产物（约100pgDNA）经变性后用手动芯片点样仪点于尼龙膜上，与生物素标记的外源目的基因片段进行斑点杂交，用很少的材料在短时间内就得到了比传统方法更为理想的杂交结果。
采用本方法可以对转基因植株进行批量检测，材料用量少、操作简单快捷、结果可信度高，与其它方法相比具有明显的优势。
1、材料和方法
1.1 植物材料和试剂
转基因烟草
用叶盘法将水稻的基因OSsec27p（GenBank Accession no.DQ434847）转入烟草（Nicotiana tabacum L.cv.W38），所得T0代植株在16h光照（25℃）/8h黑暗条件下培养。
1.2 方法
1.2.1 转基因植物的PCR鉴定
随机挑取六株T0代转基因烟草，采用植物基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取基因组DNA模板，另外分别以未转化的野生型烟草基因组DNA以及含有OSsec27p的重组质粒作为阴性和阳性对照模板，使用OSsec27p基因特异性引物进行PCR扩增。
取部分扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测无误后，从剩余产物中采用DNA产物纯化试剂盒（北京天根生化科技有限公司）回收纯化PCR产物，去除过量引物分子，用紫外分光光度计进行定量，均调整DNA浓度约为20ng/μl。
1.2.2 手动芯片点样仪的使用
本试验使用V&P Scientific VP478手动芯片点样仪，包括4部分：玻片复印仪（Glass Slide Replicator）、手动玻片定位系统（Manual Glass Slide Indexing Unit）、清洗装置（Glass Slide Microarrayer Wash and Blot Station）和微孔板定位系统（96-Well Microplate Indexing Unit）。
操作过程按说明书进行，稍改动简述如下：
装针、洗针：将所配8根点样针装入玻片复印仪，使用前在清洗装置中盛入漂白剂、蒸馏水和无水乙醇，交替清洗点样针。
装片：将尼龙膜（Milipore）裁成比载玻片（W18×T36mm）略小的形状，用双面胶或胶水将两侧边缘固定在玻片上，装入手动玻片定位系统。
取样：首先将96孔板装入微孔板定位系统中，然后分别取纯化的转化和未转化植株PCR产物以及从重组质粒中酶切回收所得目的基因OSsec27p，经煮沸变性10min后冰浴5min后按设计的顺序（见图2左侧）加到96孔板中。最后将玻片复印仪装入微孔板定位系统的相应位置，压下复印仪从96孔板中蘸取溶液。
点样：将玻片复印仪装入手动玻片定位系统，压下复印仪一次在尼龙膜上点下8个点，然后重新取样，调节手动玻片定位系统在同一张膜上垂直方向间隔4.5mm重复点样一次，两次点样共计16个点。同样的操作一共点3张膜，共6次重复48个点（见图2）。
点样完成后将尼龙膜从玻片上取下，用紫外交联仪（CL-508.G，UVitec）80W照射3min以固定DNA。
1.2.3 探针标记、杂交和检测
以OSsec27p作为探针，按照North2South® Biotin Random Prime DNA Labeling and Detection Kit（PIERCE）使用说明进行探针标记、杂交和信号检测。X光片曝光时间为30s。
2、结果
2.1 转基因烟草的PCR初步鉴定
转基因烟草的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析如图1所示。以转基因烟草基因组DNA为模板进行扩增均能得到预期1.8kb的条带（Lane 1～6），与阳性对照（含有OSsec27p的质粒）一致（Lane 8），而阴性对照（野生型烟草基因组DNA）中未出现（Lane 7），说明结果可信。但还需要用斑点杂交的方法进一步确认其序列信息。
2.2 PCR-dot-blot
将1～4号及7号PCR产物回收纯化除去引物，与OSsec27p的DNA溶液一同调整DNA浓度约为20ng/μl，一同用芯片点样仪点于尼龙膜上（斑点直径约500～780μm），每次点样均设置阳性和阴性对照，各样品的位置如图2左侧所示。然后以生物素标记的OSsec27p为探针进行杂交，所得X光片成像结果如图2右侧所示。成像斑点清晰，三张重复膜的结果一致，被检转基因植株全为阳性，阴性对照处未检出杂交信号，阳性对照明显。
3、讨论
PCR的方法用于检测转基因植物非常简便，但是其高灵敏度的特点容易导致假阳性结果，须经PCR产物克隆测序最终确认，如果用于鉴定大批量的转基因植物将会相当的费时费力。为此我们借助芯片点样仪样品量少、操作方便、重复性好等优点，采用快速、安全的生物素标记探针杂交法对转基因植物的PCR产物进行鉴定。为保证结果的真实性，一方面将PCR产物回收纯化除去残留的引物防止产生假阳性结果，另一方面在点样时设置严格的阴性和阳性对照，整个过程可行且可信。
斑点杂交是一种简便、经济的分析DNA或RNA的方法，被广泛用于研究基因表达、外源基因的整合情况以及疾病检测等。虽然目前已经发展了多种点样方法，可是要么重复性差，要么需要复杂昂贵的设备，相比之下我们使用的手动芯片点样仪具有以下显著优点：
节省材料：样品用量少，每次每针取样仅为6nl（约120pg），大大节省了宝贵的转基因植物材料。另外，一张膜上最多可点768个点（视样品溶液扩散情况而定），可以同时处理多个样本。如此大的容量意味着检测相同数量的样品要比传统方法节省很多试剂，比如抗体、杂交缓冲液、洗膜液等，能够显著降低检测的成本。
使用方便：可方便的从微孔板中取样制备芯片，一次可以制作2张芯片，配合附带的清洗装置，可以在很短时间内完成大批量样品的点膜过程。本试验中点三张膜总共用时不到3min。如果用于RNA样品检测，可以减少RNA降解的可能。即便有部分降解，只要及时完成紫外交联使其固定在膜上，也能顺利得到杂交结果。
重复性好：具备精确的水平和竖直定位系统，上样量稳定，斑点的位置、间距和直径都比较稳定，不同膜之间点样差异很小，可以用作半定量分析。
需要说明的是，使用放射性同位素标记DNA的灵敏度是生物素等非放射性标记所无法企及的。但是在本试验中，对基因组DNA用外源目的基因特异性引物进行PCR鉴定可以在保证特异性的前提下大大增加目的片段拷贝数；所以使用生物素标记探针结合商品化试剂盒中成熟的化学发光与检测体系能够在很短时间内得到理想结果，从点膜到完成X光片定影只需一个工作日。
综上所述，这样一套PCR-dot-blot的方法融合了PCR、芯片和斑点杂交的优点，节省材料、灵敏度高、特异性好，最重要的是简便快速，可以有效地节省时间和人力。此外由于该方法简单易学、成本低廉、便于推广，只需适当修改实验设计，便可用于不同对象的检测，因而具有较高的应用价值。
