血清学实验—玻片凝集与肥达反应

【材料】

伤寒杆菌，甲、乙型副伤杆菌，痢疾杆菌诊断血清，载玻片，生理盐水等。

【方法与结果】

根据初步鉴定结果，用已知诊断血清作玻片凝集试验，如发生凝集，即可确定。如疑集阴性，应复查后再定。

（二）继续鉴定：根据需要可进一步作生化反应，血清学分型等鉴定。

【注意事项】

1. 作分离培养时宜取脓血便接种于鉴别培养基或选择培养基上。

2. 挑取可疑菌落时，每份标本可选取2~3个菌落，每个菌落接种一支双糖管。

3. 玻片凝集确定后，如果需要，可保存菌种，以便进一步鉴定和研究用。

《附录》

1、伊红美兰（简称EMB）培养基制备

1） 成份：

① pH7.6%无糖琼脂 100毫升

② 20%乳糖溶液 2毫升

③ 2%伊红水溶液 2毫升

④ 0.5%美兰水溶液 1毫升

2）制法：将上述成分混合溶化，8~10磅高压蒸气灭菌15分钟，制成平板备用。

3）应用原理：培养基中含有乳糖，伊红及美兰指示剂，伊红系酸性染料，当大肠杆菌分解乳糖产酸时，细菌带正电荷，而染上伊红，伊红与美兰结合形成紫黑色化合物，所以菌落呈出紫黑色，且有金属光泽；致病菌不分解乳糖故其菌落不变色，较透明，培养基中加入的染料还可抑制其他革兰阳性菌生长。

2、双糖铁培养的制备

1） 成分：

牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g，硫代硫酸钠0.05g，硫酸亚铁0.5g，葡萄糖0.1g，乳糖1g，琼脂1g，酚红0.025g，蒸馏水100ml。

2） 制法：将上述成分（除琼脂及酚红）混合，加热溶化，矫正PH至7.4~7.6。再加入琼脂及酚红，煮沸，分装小 试管 内，每支约2ml，经10磅15分钟后，置成高层斜面，冷凝后即成。

3） 使用原理：克氏双糖铁培养基中含有葡萄糖、乳糖、硫酸亚铁及酚红指示剂等成份。经菌分解葡萄糖产酸时，使培养基的下层由红变黄，斜面培养基中虽然也含有葡萄糖但量小，且分解产生的酸为挥发性酸，所以只发酵葡萄糖的细菌斜面仍为红色；产酸并产气时，培养基中有气泡或裂隙出现。

培养基中乳糖含量大，被分解后产酸多，因此不仅培养基下层变黄，而且斜面出由红变黄，基于上述现象，通常将培养基的斜面部分代表乳糖，下层部分代表葡萄糖。培养基中含有硫酸亚铁，如有硫化氢产生，则生成黑色硫化铁，使培养基中出现黑色。

一、肥达反应

【原理】

肥达试验是一种 试管 凝集反应。用已知的伤寒杆菌O、H抗原和甲、乙型副伤寒杆菌H抗原，与病人血清作定量凝集试验，以测定患者血清中无相应抗体存在，作为伤寒、副伤寒诊断的参考。

【材料】

1.患者血清1：10稀释

2.伤寒杆菌O菌液、H菌液、甲、乙型副伤寒H菌液

3.生理盐水、试管、吸管、56℃水箱等

【方法】

1.取清洁小试管32支，分成4排，每排8支，依次编号。

2.于小试管内各注入0.5ml生理盐水。

3.于每一排第一管内加入1：10稀释的患者血清0.5ml，用1ml吸管吹吸三次，混匀，吸出0.5ml注入第二管作对倍稀释，……依次稀释至第7管，弃去0.5ml，第8管为对照。

4.从第8管开始，从后向前，第一排各管内注入伤寒杆菌H菌液0.5ml；第二排各管注入伤寒杆菌O菌液0.5ml；第三排各加入甲型副作寒杆菌H液0.5ml；第四排各管加入乙型副伤寒杆菌H菌液0.5ml；

5.加完菌液后，振荡试管架，混匀，置于56℃ 水浴 箱2~4小时，放冰箱过夜，或放置37℃ 水浴 箱18小时后观察结果

肥达氏反应操作表 单位:ml

【结果与分析】

先观察对照管，正确结果应无凝集现象，再观察各试验管的凝集现象，凝集程度以“+”多少表示之。

（++++）最强，上液澄清，细菌全部凝集沉淀于管底。

（+++）强，上液轻度混浊，细菌大部分凝集沉淀于管底。

（++）弱，上液混浊，细菌少部分凝集。

（-）不凝，液体呈乳状与对照管相同。

效价判定：以能出现“++”凝集现象的血清最高稀释度为该血清的凝集效价。