【转帖】shRNA序列的设计方法

短发夹RNA (small hairpin RNA，shRNA)可在细胞中被加工成siRNA。设计shRNA时，shRNA中两个反向重复序列的设计原则与siRNA序列的设计相同，需要重点考虑的是shRNA 环序列的长度及组成，而且环序列不能与靶基因内的其它序列具有同源性。

1 .shRNA环序列的长度

一般来讲，设计shRNA时选择3～10 nt长度的发夹环均可。Brummelkamp等[18]构建了具有5 nt、7 nt、9 nt环的shRNA，比较它们在MCF?7细胞中抑制CHD1基因的效果：9 nt环的shRNA抑制率达90％；7 nt环的shRNA只有中等的抑制率；5 nt环的shRNA则无抑制活性。但是Siolas等[8] 报道，环序列的长度对RNAi效率无明显影响。

2.hRNA环序列的组成

研究表明，当shRNA发夹环的组成为 “UUGAUAUCCG”和“UUCAAGAGA”时具有较高的抑制效率。当发夹环前面的序列是以“UU”终止时，应该选用“CCACACC”环序列[12]。环序列中有2个U对产生有效的基因抑制很重要[18]；但环序列中不能有连续3个以上的U[12] ，因为这可能导致shRNA转录的提前终止。

3 .siRNA阴性对照序列的设计

所有的RNAi 试验均应设立阴性对照，siRNA 阴性对照序列的合理设计与siRNA 序列的设计同样重要。因为有效的对照可以充分证明siRNA 只对靶基因产生特异性基因沉默，从而增强实验的可信度。阴性对照siRNA包括碱基错配或混乱序列的siRNA。在实验中最好设计两条siRNA 对照序列。

3.1碱基错配的阴性对照siRNA

最初的研究证明，在siRNA双链内，一个碱基的突变就足以阻断RNAi 过程。反义链内具有1～2 个碱基错配的阴性对照siRNA可用于鉴别RNAi 通路和micro RNA 通路，因为后者是由碱基的非精确配对引起。最近的研究表明：siRNA 允许其分子中心部位存在单个碱基突变，siRNA完全失活需要大于3个碱基的突变[19]，在Mangeot [20]的研究中，对照siRNA序列中含有6个精确定位的突变碱基，也证明了这点。

Kim 等[7]的研究表明，在27 nt的siRNA中，有3个碱基错配的对照siRNA序列可以在不同的浓度下阻断针对靶基因的RNAi过程，而单个碱基错配的siRNA仅在相对高的浓度下才可阻断RNAi过程，所以多碱基错配比单碱基错配的siRNA阴性对照序列具有更高的实际应用价值。

此外，对于RNAi效应而言，位于siRNA序列中部的碱基错配比位于siRNA序列尾部的碱基错配更有效。

3.2 混乱序列的阴性对照siRNA

来源于siRNA序列的混乱序列siRNA，在siRNA实验中是一个阴性对照，作为一个信息控制可反映RNAi的特异性。混乱序列siRNA与siRNA序列相比具有相同的核苷酸组成，但是核苷酸顺序被打乱，同样要保证它和靶mRNA没有同源性。