反应体系的建立及优化

1. SG浓度：

　　终浓度1:5,000－1:100,000，一般为1:10,000—1:70,000

2. Primer浓度：

　　终浓度50nM－300nM
　　固定摸板浓度的梯度实验
　　不加摸板的对照实验（NTC）——有无非特异信号
　　熔解曲线的分析——是否单峰
　　建议使用HPLC纯化的引物

3. MgCl2浓度：

　　降低MgCl2浓度以减少非特异性产物
　　最低可至1.5nM
　　同时做梯度实验和NTC对照

4. 反应温度和时间参数：

　　反应温度参考所用酶的种类
　　退火温度使用温度梯度功能优化
　　反应时间与常规PCR类似，扩增片断一般为200－300bp

5. TaqMan探针：

　　引物、探针设计：
　　首先选择探针序列
　　探针的Tm值为68－70度，长度不应超过30碱基
　　探针的5’端不应是G，G有可能会淬灭荧光素
　　引物应尽量靠近探针，扩增片断不超过400bp，通常为80－150bp
　　引物的Tm值为59－60度，长度约20碱基
　　避免引物、探针之间的二级结构

委托合成公司设计

　　使用辅助软件
　　确定反应参数
　　一般为两步法，94度10－20s
　　60度30－60s （Taq酶的5’外切酶活性在60度最强）
　　通过温度梯度优化退火温度
　　三步法， 72度45s
　　优化引物探针浓度

目标：最高的信号/背景比

　　最小的Ct值
　　引物浓度：50nM－900nM
　　探针浓度：50nM－250nM
　　通过多次实验确定各自的浓度和比例