PCR反应体系的其他优化策略

PCR 反应体系的其他优化策略

 

    1、增强剂：一系列辅助物如DMSO（1%～10%）、PEG-6000（5%～15%）、甘油（5%～20%）、非离子去污剂、甲酰胺（1.25%～10%）和牛血清白蛋白（10～100μg/ml）等可以加到反应中以提高特异性和产量。有些反应只能在这些辅助物存在时才能扩增。

 

    2、热启动PCR：Tag酶在低温下仍有活性，当所有的反应成分混合后进入循环前，一些非特异性的配对可被延伸而产生非特异性产物。热启动PCR（在温度达到70℃时再加入酶或模板DNA）可克服这个问题。第二节中推荐的标准扩增程序中先将不含酶的反应混合物于94℃变性5～10min，再加酶进入循环，是热启动的一种方法。

 

    3、嵌套式PCR：嵌套式PCR对于减少或消除不需要的产物同时提高灵敏度是非常成功的。首先在常规条件下用第一套跨越目的DNA片段的引物扩增，假象产物经常会与引物中的一条或两条配对，但其内部却是无关序列。接着对一部分反应物-产物混合物进行新一轮扩增，采用的引物与第一对引物的内侧序列配对，在这一轮扩增中只有真正的产物被扩增。这种方法即使在目的产物开始用EB染色检测不到而且有假象带时也常常获得成功。如果采用嵌套式PCR方法，第一轮扩增在20个循环左右终止而不是像通常的在第30～35个循环终止会获得更好的结果。

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