有图有真相，专业技术工程师带你一起轻松玩转 ChIP 实验

染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）是研究细胞内 DNA 与蛋白质相互作用的经典技术，特别是经常用于研究某些转录因子与特定基因组区域（如启动子或其它 DNA 结合位点）的结合，或者用来评价基因组特定位点的组蛋白修饰水平。

CST 推出的 SimpleChIP® 酶解法试剂盒有 9002，9003，9004 和 9005均含有标准 ChIP 流程所需的整套试剂、阳性对照组蛋白 H3 抗体、阴性对照 IgG、人和鼠 RPL30 阳性引物引物和 ChIP 级蛋白 G 琼脂糖微珠或蛋白 G 磁珠等，方法简便易行，与 CST 多种高质量的 ChIP 级抗体配合使用，将使您的 ChIP 实验质量提升到一个新的高度。

ChIP 概况图解：

在 ChIP 实验中，染色质样品的制备最为关键。

为了让您能够更直观地看到酶解法 ChIP 染色质样品的制备过程，我们将 CST 技术工程师最近与客户一起进行的标准 ChIP 实验样品制备的关键步骤给您呈现，希望我们能够带你一起轻松做好 ChIP 实验。

接下来全部真实记录：

时间：2016 年 3 月 8 日（看这个日子选的）

地点：清华大学生物医学馆

人物：

左）CST 技术工程师李博士；右）清华大学某实验室苏博士（此处为实验掠影）晴朗的一天，按照约定的时间，我们如期而至。这次我们使用的 SimpleChIP® 酶解法试剂盒货号为 9003，专门用于细胞样品，所配套的 protein G 微珠为磁性微珠。

实验设计如下：

阴性对照（IgG）管 1 个，目的抗体（TCF4）管 1 个，阳性对照（组蛋白 H3）管 1 个因此，此次实验后续有 3 个 ChIP 反应，按照试剂盒的细胞数要求，每一次 ChIP 实验约需要 4×106 个细胞。

考虑到我们后续还要对酶切用量进行优化，实际准备了足量细胞（每组约 1.5×107 个细胞）。在我们实验前，我们仔细观察了细胞的状态和密度，细胞状态很健康，贴壁良好，也达到了 80% 左右的汇合率，一切都符合 ChIP 实验的要求。

拿出试剂盒，我们首先对各种标配试剂置于冰浴中进行了标记。

由于试剂盒标配的 DTT 为干粉，因此我们需要配制 1M DTT 溶液（具体地，192.8 mg DTT#7016 加 1.12 ml dH2O，确保 DTT 完全溶解）。

然后，我们取出并室温预热 200X 蛋白酶抑制剂混合物 PIC＃7012 和 10X 甘氨酸溶液＃7005，直到完全溶解。

配制 ChIP 样品制备所需要的各种试剂：

包括：

缓冲液 A（主要是对细胞膜进行裂解，同时对核膜进行打孔，以便于后续微球菌核酸酶进入核内发挥酶解作用）：我们按照实验设计，需要配 3 倍反应需要的体积，同时加入合适的 DTT 和 200X 蛋白酶抑制剂混合物（PIC），在冰上预冷。

按照说明书的描述，每 4X 106 细胞，准备 1 ml 1X 缓冲液 A（250 ul 4X 缓冲液 A #7006+750ul 水）+ 0.5 ul 1 M DTT + 5 ul 200X 蛋白酶抑制剂混合物（PIC），冰上预冷。因此，我们就把所有体积乘以 3，来配制啦，简单的算术题。

缓冲液 B（微球菌核酸酶的酶切缓冲液）：我们按照实验设计，配了 3 个反应需要的体积，同时加入合适的 DTT（此处我们牢记不能加蛋白酶抑制剂混合物 PIC！！！）。

其他：找到固定细胞用的分子生物学级别的 37% 甲醛溶液（我们用的是 SIGMA 生产的 F8775）；准备足量预冷的 PBS，用于洗涤细胞；再把离心机也调到 4 度预冷。

一切妥妥的，正式开始实验！

我们先在培养基中直接加入 37% 甲醛溶液 0.27 ml，使终浓度达到 1%（因为当时我们每盘细胞的培养基都是 10 ml，所以加入的甲醛溶液体积为 10 ml/37=~0.27 ml）。加入甲醛后，立刻将培养皿在摇床上室温缓慢摇动 1 分钟（确保彻底摇匀甲醛），然后静置 9 分钟。

接着，迅速在每个盘子里加入 1 ml 10X 甘氨酸溶液，在摇床上室温缓慢摇动孵育 5 分钟，以终止上述固定反应，这个时候你会看到培养基变色了。

由于我们使用的是贴壁细胞，所以接下来直接弃去每个盘子里的上清，然后迅速用 2 ml 预冷的 PBS 洗涤 2 次。

然后，我们加入 2 ml 含有 PIC 的 PBS，用细胞刮把每盘里的细胞全部刮下，可以重复加入含有 PIC 的 PBS，直到绝大部分细胞都被刮下，并将实验组和对照组的细胞分别汇集到 15 ml 离心管中。4°C，1500rpm 离心 5 分钟收集细胞，去除上清后立即进行后续的细胞核处理和染色质剪切。

我们先在离心管中，分别加入缓冲液 A，并用振荡器在合适的振荡频率将所有细胞重悬并混匀细胞悬液，不能有明显的细胞团块。

然后冰上孵育 10 分钟，每隔 3 分钟用振荡器混匀一次。

4°C ，3000 rpm 离心 5 分钟以沉淀细胞核。弃上清，并加入含有 DTT 的缓冲液 B 。这个时候你会发现细胞核不太容易重悬，最好用剪去前端部分的 1 ml 枪头吹打数次进行混匀。

再次离心，弃上清，并将沉淀用 300 ul 含有 DTT 的缓冲液 B 再次重悬，并将实验组和对照组细胞核样品分别转移到一个新的 1.5 ml 离心管中。此时，我们已经为后续酶切提供了一个合适的缓冲液体系。

虽然试剂盒推荐微球菌酶的一般起始量为 0.5 ul/每 4X 106 细胞，但因为我们仍然想优化一下酶切条件，找到最适的用量。因此，我们将细胞核提取物一分为 3，进行了一个梯度实验。即分别加入 0.5ul，1ul 和 1.5ul，来检测一下酶切效率。

加入不同量的微球菌酶后，37°C 孵育 20 min，每隔 3~5 分钟混匀一次。

然后每管加入 10 ul 0.5 M EDTA 终止消化，将离心管置于冰上。

4°C 13000rpm 离心 1 分钟，沉淀细胞核，弃上清。

然后将每管细胞核沉淀重悬在 500 ul 1X ChIP 缓冲液 + PIC 中，冰上孵育 10 分钟。这个时候我们用带有剪去前端部分的枪头的移液器吹打均匀。

注意了,接下来要对细胞核样品进行短暂超声了,很多第一次用这个试剂盒的同学表示不明白了，为什么又要超声咧？不是说酶解法不需要超声了吗？

小伙伴们，此处超声是别有用意的，它可以彻底破碎酶切后细胞核样品中残留的核膜，让染色质充分释放到 ChIP 缓冲液中。因为我们前面的缓冲液 A 仅仅是将核膜打了孔，并没有完全裂解，短暂的超声还是非常必要的。

为了让大家更好的看到超声装置的实际情况，我们把我们当时自制的一个冰水混合体系给您秀一下。

我们使用最大功率为 100W 左右的超声破碎仪进行超声处理，使用 3 mm 的探头，设置超声功率为最大功率的 30%～40%，对细胞核进行每次 20 秒，共 3 次（累计 60 秒超声）的超声处理以达到完全破碎的效果。每次超声处理间隔 30 秒并置于冰上以防止超声引起样品过热。我们按照预定调节设定了程序，然后就如法炮制，一切 okay！

4°C， 10000rpm 离心 10 分钟，除去样品中的细胞核碎片，分别将上清转移到一个新管子中，即为交联的染色质样品。然后我们分别取出 50 ul 染色质样品用以分析 DNA 的酶切情况。

对分出的 50ul 样品，我们按照标准的解交联和 DNA 纯化步骤回收了其中的 DNA 样品，一部分进行了 DNA 浓度测定，然后将剩余的 DNA 样品利用 1% 的琼脂糖电泳进行分离检测，如下图所示:

Lane 1：0.5ul

Lane 2：1.0ul

Lane 3：1.5ul

从上图我们可以看出，微球菌酶切后，染色质 DNA 的分布主要是在 150，300，和 500bp 左右，但由于 2 号泳道的样品在 1000bp 以上的片段切割的更加充分（没有太多信号），所以我们决定利用 2 号泳道对应的染色质进行后续 ChIP 实验。

由于时间问题，后续实验是苏博士单独完成的，他后来按照标准的实验流程顺利完成了实验，初步的预实验结果如下图所示：

这和实验报道以及我们内部实验结果都是一致的，现在苏博士正在进行后续规模化的实验。