原生质体分离与体细胞杂交

互联网2013-07-12

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1. 原生质体分离

1.1 实验材料: 烟草无菌苗叶片，烟草悬浮细胞系。

1.2 实验操作

a. 取生长3周的烟草无菌苗平展嫩叶，置于含有一薄层600mmol/L甘露醇-CPW溶液中，置于4℃黑暗下预处理6-8小时；

b. 用吸管吸去预处理液，然后加入用CPW盐溶液配制，经过过滤灭菌的含有2％纤维素酶、0.4％离析酶、600mmol/L甘露醇的酶溶液，用封口膜将培养皿封严，置于暗处在24~26℃下保温酶解16~18h；

c. 在倒置显微镜下观察，叶片细胞壁已降解，有圆球形原生质体释放到溶液中，即终止酶解。用吸管轻轻压挤叶片，以释放出全部原生质体；

d. 通过一个60~80μm的细胞筛过滤以除去较大的碎屑。滤液置于1个螺帽离心管中，在100g下离心3min，使原生质体沉降；

e. 弃取上清夜，将沉降物缓慢加入含有CPW配制的860mmol/L蔗糖溶液的螺帽离心管中，在在100g下离心10min；

f. 将蔗糖溶液的顶部绿色原生质体带收集起来，并转入到另一个离心管中。在离心管中加入原生质体培养基以使原生质体悬浮，在100g下离心3min，重复本相清洗过程至少3次；

g. 最后一次清洗之后，加入培养基调整原生质体密度至0.5×105到1×105/ml。将原生质体按讲授的方法培养。

附CPW配方：

2. 原生质体密度测定

原生质体密度测定一般用血球计数板。

2.1 血球记数板的构造

记数板是1块特制的厚载玻片，上面有4条与玻片长边垂直的槽，每2个槽之间构成1个平台，故共有3个平台。其中两侧平台比中间平台高0.1mm，中间平台较宽，又有1条与玻片长边平行的短槽将其一分为二，在每一半上各刻有1个记数室，每个记数室划分为9个大方格。

每个大方格面积为1mm×1mm，深度为0.1mm，盖上盖玻片后容积为1 mm3（即0.1μl或10-4ml）。中央的大方格又用双线划分为25个中方格。每个中方格又用单划线划分为16个小方格，共计400个小方格，原生质体记数即可在中央的大方格内进行。

2.2 记数方法

a. 首先在显微镜下检查记数板上的记数室是否干净，若沾有污物，须用酒精棉轻轻擦洗，用蒸馏水冲静，再用吸水纸吸干；

b. 将盖玻片盖在记数室上面；

c. 将悬浮培养基中的原生质体悬浮液滴在盖玻片一侧边缘，使它沿着盖玻片和记数板间的缝隙渗入记数室，直到充满记数室为止；

d. 记数时要使显微镜栽物台保持水平，不能倾斜。依次逐个记数中央大方格内25个中方格里的原生质体，然后根据下式求出每毫升中的原生质体数：

1ml悬浮液中的原生质体数=1个大方格悬浮液（0.1 mm3，即0.1μl）中的原生质体数×10×1000；

e. 记数完毕后，将记数板洗净吸干。

3. PEG诱导原生质体融合的实验程序

a. 按照原生质体分离的方法，同时分离烟草叶片和悬浮细胞的原生质体；

b. 将原生质体密度调整为4E+5个/ml的原生质体悬浮液备用；

c. 在1个60×15mm的培养皿中滴1滴（2-3ml）硅液200，然后在硅液上面放一张22×22mm的盖片；

d. 将叶片原生质体和悬浮细胞原生质体等体积（一般各0.5ml）混合，然后用吸管吸取大约150μl原生质体悬浮液置于盖玻片上。静止大约5 min，以使原生质体沉降在盖片上形成一个薄层；

e. 然后在原生质体悬浮液中，加入等体积的PEG溶液（50% PEG1540，10.5mmol/L CaCl2·2H2O，0.7mmol/L KH2PO4·H2O）。室温（24℃）下，将PEG溶液中的原生质体保温10-20 min.，在倒置显微镜下观察原生质体粘连的情况；

f. 以5 min间隔轻轻加入2滴稀释液（50mmol/L甘氨酸，50mmol/LCaCl2·2H2O，300 mmol/L葡萄糖，pH9-10.5），保持5 min后，加入1滴原生质体培养基；

g. 用新鲜的原生质体培养基，以各为5 min的间隔，将原生质体清洗5遍，每次洗完之后，不要把盖片上的培养基全部去掉，要在原生质体上留下一薄层旧培养基，而将新鲜培养基加于其上。此时可在倒置显微镜下，根据叶绿体标记统计异核融合率；

h. 洗涤完成后在盖玻片上滴大约500μl原生质体培养基，在盖玻片周围以小滴形式再加入500-1000μl培养基，以保持培养皿内的湿度，封口后置于25℃黑暗条件下培养。