细菌血清学鉴定法

血清学反应是指相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀或凝集现象。在微生物检验中，常用血清学反应来鉴定分离到的细菌，以最终确认检测结果，是临床细菌性疾病诊断和病原菌鉴定的重要手段之一。

血清学试验可分为血清学鉴定和血清学诊断两部分。用已知抗体(即含特异抗体的免疫血清或单克隆抗体等)检测标本中或分离培养物中未知细菌的种、型或细菌抗原，称为血清学鉴定；

而用已知细菌或特异性抗原检测患者血清中有无相应抗体及其效价的动态变化，作为某些感染性疾病的辅助诊断，称为血清学诊断。血清学试验基本类型包括凝集反应、沉淀反应和补体结合反应等。

一、玻片凝集试验

【实验目的】

1. 掌握玻片凝集试验的操作方法，了解其特点和用途。

2. 学习玻片凝集试验结果的观察方法。

【实验原理】

当颗粒性抗原与相应抗体特异结合后，在适量电解质存在的条件下，可逐渐聚集，出现肉眼可见的凝集现象。

【试剂与器材】

1． 诊断血清：1∶10稀释的伤寒杆菌诊断血清。

2． 菌种：伤寒杆菌、痢疾杆菌24 h琼脂斜面培养物。

3． 器材：载玻片、毛细吸管。

4． 试剂：生理盐水。

【实验方法与步骤】

1． 取清洁玻片一张，用蜡笔划为三格，并注明号码。无菌操作下，用接种环于1、2格内加1∶10稀释伤寒杆菌诊断血清1～2滴，第三格加1～2滴生理盐水。

2． 无菌操作下，用接种环取伤寒杆菌培养物少许，混于第三格中，再混于第一格中（不能先混第一格再混第三格，因为这样将使诊断血清混入盐水而影响对照结果），将细菌与盐水或血清混合均匀使呈乳状液。此时取菌量不可过多，使悬液呈轻度乳浊即可。

3． 同法取痢疾杆菌培养物少许，于第二格内混匀。

4． 轻轻摇动玻片，经1～2min后肉眼观察，出现乳白色凝集块者，即为阳性反应；仍为平等的乳浊液者，即为阴性反应。如结果不够清晰，可将玻片放于低倍显微镜下观察。

二、试管凝集反应——肥达反应

【实验目的】

1. 掌握肥达的操作方法，了解其特点和用途。

2. 学习肥达反应结果的观察方法。

【实验原理】

试管凝集反应是一种半定量的凝集反应。常用已知抗原测定受检血清中有无相应抗体及其含量，以辅助临床诊断或供流行病学调查分析。

【试剂与器材】

1． 诊断血清：1∶10稀释伤寒杆菌“H”血清、1∶10稀释伤寒杆菌“O”血清。

2． 菌液：伤寒杆菌“H”菌液、伤寒杆菌“O” 菌液。

3． 试剂：生理盐水。

4． 器材：小试管、吸管。

【实验方法与步骤】

1． 取洁净小试管14只分两排排列于试管架上，每排7只依次用蜡笔注明号码，于每管中分别加入0.5 ml生理盐水。

2． 在第1排第1管中加入1∶10稀释伤寒“H”血清0.5 ml，使血清与盐水充分混合，而后吸出0.5 ml注入第2管，同样予以混匀后吸出0.5 ml注入第3管。以此类推，稀释到第6管，自第6管吸出0.5 ml弃去。此时，自第1管至第6管的血清稀释倍数为1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640。第7管不加血清作为对照。

3． 同法用吸管吸取1∶10稀释伤寒杆菌“O”血清加入第2排第1管，并依次如上法予以稀释。

4． 用移液管吸取伤寒杆菌“H”菌液，加入第1排各管中每管0.5 ml，此时血清稀释倍数又增加了一倍。

5． 同法于第2排各管中加入伤寒“O”菌液0.5 ml。

6． 将各管振荡混匀，放37℃水浴箱中2~4h或37℃孵育箱中过夜，次日取出观察结果。

【观察结果】

1． 对照管无凝集现象，管内液体仍呈混浊状态。但如放置时间较长，细菌堆于管底成小圆点状，为阴性反应。

2． 试验管与对照相比可见管底有不同大小的圆片状边缘不整齐的凝集物，上清则澄清透明或不同程度混浊。凝集的强弱可用“+”号表示如下：

“++++”凝集很强，管内液体完全澄清，凝集块完全沉于管底；

“+++”凝集强，管内液体不完全澄清稍有轻度混浊，凝集块沉于管底；

“++”凝集中等强度，液体半澄清，凝集块沉于管底；

“+”凝集弱，管内液体混浊，少量凝集块沉于管底；

“－”不凝集，管内液体和对照管同样混浊，无凝集块。

3． 记录观察的结果并判断凝集效价。通常以能产生明显凝集（++）的血清大于稀释倍数作为该血清的凝集效价。如血清的最低稀释度（即第1管1:40）仍无凝集应报告为低于1:40。如血清的最高稀释度（即第6管1:1280）仍显完全凝集现象，应报该血清效价高于1:1280。

【注意事项】

观察切勿摇动试管，以免凝集块分散。

　思 考 题

1. 生理生化反应鉴别细菌的原理是什么？

2. 细菌生理生化反应试验中为什么要设对照？

3. 血清学试验有哪些类型类型？

4. 影响血清学试验的因素有哪些？