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流式细胞仪检测益肺清化颗粒对荷瘤小鼠瘤组织E-cad CD44v6表达水平的影响

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益肺清化颗粒是朴炳奎主任医师积多年的临床经验,并经国家“七五”攻关进一步开发,研制出的治疗肺癌的有效方药,已经上市近10年。经临床和基础研究证实,该药可抑制病灶进展,有效延长患者的生存期。现选取该药对肺癌侵袭转移过程中黏附分子表达水平的影响,以深入探讨该药的作用机制,更好地指导临床用药。

1、材料与方法

1.1仪器 FACSort 流式细胞仪(FCM),美国Becton-Dicknson公司;离心机himacCF1502,日本HITACHI。

1.2 试剂 CD44v6分子,boster公司,编号:BA0454;
  上皮型钙黏附分子(E-cadherin,简作E-cad)boster公司,编号:BA0475;抗免IgG-FITC荧光标记二抗,美国Sigma公司,编号:F9887;P.B.S 0.01M pH7.2~7.4磷酸盐缓冲液,美国Gibo公司;PFA:paraformaldehyde 多聚甲醛,美国Sigma公司。

1.3 药物 环磷酰胺注射液(CTX):上海华联制药,批号:20030815。

1.4实验方法

  药物用法 肺瘤平膏:根据人与小鼠体表面积比系数折算,相当于人等效剂量的5倍,每天1 次,灌胃给药,连用15天;CTX每次60mg/Kg体重,腹腔注射给药,分别于第3、7、11、15天给药1次。空白对照组予洁净自来水灌胃,每天1次,连用15天。

  标本制备

  动物:C57BL/6小鼠,雄性,体重18~22g,二级动物房,常规饲养,由中国医学科学院实验动物中心提供,合格证编号:01-3001。

  瘤源及方法:Lewis肺癌瘤株,由医科院药物所提供。移植后10天,选择表皮无破溃,肿瘤生长良好的荷瘤小鼠,无菌取瘤组织,去掉瘤组织周围脂肪、筋膜等软组织,用无菌生理盐水冲洗3次,称重,剪成小块,研磨,按1:3用生理盐水稀释,细胞浓度约为1×107/ml,每只小鼠0.2ml接种于小鼠右上肢腋部皮下组织。

  C57BL/6小鼠45只,随机分为中药组、CTX组及空白对照组。每只小鼠均右侧腋窝皮下接种肿瘤匀浆液0.2ml/鼠。第2天开始灌胃给药,连续15天,CTX线腹腔注射给药。第21天颈椎脱臼处死动物,结束实验。

  流式细胞仪检测流程:处死小鼠,取瘤组织,称重,生理盐水冲洗;于100目不锈钢滤网上加2ml生理盐水研磨,形成单细胞悬液,瘤液移入试管内,离心(1000r/min),去上清;加入2ml蒸馏水1min并加入4ml1.8%高渗盐水,混匀后即离心(1000r/min)5min,去上清;加PBS4ml离心(1000r/min)5min×2,去上清;加PBS2ml,吹打,分装,每管200μl(肿瘤细胞数约在1×106/ml)离心,去上清;加一抗50~100μl(对照组加等量PBS),4℃孵育30min,1mlPBS,离心,去上清×2;加50μl二抗(荧光抗体), 4℃孵育30min(染色在暗处进行),1mlPBS,离心,去上清,重复1次;加0.8~1ml1%PFA 4℃保存,可于3~4天内上机检测。

  检测方法 测定采用美国BD公司出品FACSort流式细胞仪。校正机器后,先设定收集门,以固定条件收集样本。每个样品管收集104个细胞后进行分析。采用Macintosh Ouadra650计算机和CellQuest软件收集处理样品数据。机器测试条件为FSC电压E-1,增益6.72;SSC电压335mV。

1.5统计学方法 采用SPSS10.0软件进行统计。

2、结果

流式检测结果显示:中药治疗后瘤组织内的E-cad水平呈高表达状态,阳性表达率达14.77%,优于CTX组内6.16%和对照组2.75%的表达水平。其中中药组与对照组的表达水平比较有非常显著的差异(P<0.01);CTX组与中药组比较差异不明显。

中药治疗后瘤组织内的CD44v6水平呈低表达状态,阳性表达率为3.73%,弱于CTX组10.8%和对照组13.48%的表达水平。其中中药组与对照组的表达水平相比较,有较为显著的差异(P<0.05);CTX组与中药比较差异不明显。见表1

表1 E-cad、CD44v6在肿瘤细胞的表达结果(±s)

<o:p> </o:p>

样品数(个)

E-cad(%)

P值

CD44v6(%)

P值

中药组

10

14.77±12.22※※

0.004

3.73±1.88※

0.036

CTX组

8

6.16±2.70

1.000

10.8±3.73

1.000

对照组

8

2.75±1.20

<o:p> </o:p>

13.48±7.04

<o:p> </o:p>

注:与对照组比较,※P<0.05,※※P<0.01。注:与对照组比较,※P<0.05,※※P<0.01。

3、讨论

3.1 肺瘤平膏(上市前名为:肺瘤平膏)以近年常用的方剂为依据拟定,选药遵从中医理论的指导,并选用了现代科学实验证实有抑瘤作用的药物。功能为:益气养阴,清热解毒,兼化痰止咳。药物为:黄芪、党参、沙参、麦冬、桔梗、紫菀、拳参、仙鹤草、白花蛇舌草等。

方中黄芪补肺气之不足,党参、甘草补脾和中护胃,沙参、麦冬养肺胃之阴,紫菀、桔梗等利肺降气,化痰止咳,兼以引药入肺经,拳参、仙鹤草、白花蛇舌草等有抑制肿瘤的作用。

临床治疗195例晚期原发性肺癌患者,且与144例化疗病人对照观察疗效发现:较之化疗,肺瘤平膏可有效改善患者咳嗽、痰量、胸痛、气短、乏力等症状,可有效增强体质、提高生存质量、稳定病灶、延长生存期,且无明显毒副作用。

目前已知肿瘤的浸润和转移与期黏附分子表达的改变有关。一方面,肿瘤细胞某些黏附分子表达的减少可以使细胞间的附着减弱,肿瘤细胞脱离并与周围细胞的附着,这是肿瘤浸润及转移的第一步;另一方面,肿瘤细胞表达的某些黏附分子使已入血的肿瘤细胞得以黏附血管内皮细胞,造成血行转移。

近几年国内处研究认为E-cad介导Ca++依赖性的同种细胞之间的黏附,在维系癌细胞的上皮形态和功能方面起着某种关键性作用。E-cad属于侵袭抑制因子,E-cad基因属转移抑制相关基因,其通过促进同质细胞间的黏附,使肿瘤细胞之间保持密切接触,难以脱离原发瘤进入周围组织和血管。

E-Cadherin分子表达水平降低与肿瘤细胞恶性程度显著相关,且E-Cadherin分子与肿瘤浸润能力呈负相关。大量的资料显示,E-Cad及其相关蛋白表达与肺癌侵袭与转移机制关系密切,并可能成为判断肺癌治疗效果和预后的可靠指标之一。

转移性肿瘤细胞与血管内皮结合后,还必须黏附并浸润到内皮下基底膜和ECM,,CD44分子在此过程中起着重要的作用。不同的CD44分子在肿瘤浸润与转移过程中的作用可能是不同的,正常组织细胞或非转移的癌细胞主要表达CD44,而具有转移能力的癌细胞主要表达CD44V。其表达的持续性和严重程度在进行肿瘤诊断和预后具有重要的意义。

CD44基因表达与肿瘤的生长、浸润、转移关系密切。研究认为,CD44V6变异体可能通过促进癌细胞与血管内皮和ECM的黏附促进肿瘤向基质侵袭,从而影响肿瘤细胞的迁移和运动能力,也有研究认为,CD44V6可能通过影响癌细胞的骨架构象和分布,从而影响癌细胞的运动能力和癌转移。

3.2 结论 实验使用流式细胞仪检测了用药后荷瘤小鼠体内移植的Lewis肿瘤细胞表达E-cad、CD44V6的情况。研究证实,肺瘤平膏可有效地提高E-cad、CD44v6的情况。研究证实,肺瘤平膏可有效提高E-cad、CD44v6的表达水平。对照组CTX对E-cad、CD44v6的作用不肯定。

其抗肿瘤作用的机制,考虑与提高E-cad的表达水平,从而增加肿瘤细胞间粘附能力,降低肿瘤细胞脱落进入周围组织和血管的机率;同时,肺瘤平膏尚可降低CD44v6的表达水平。

可能通过减弱肿瘤细胞与血管内皮和ECM间的异质粘附,降低肿瘤向基质侵袭,影响肿瘤细胞的迁移和运动能力,或可能通过影响癌细胞的骨架构象和分布,从而影响癌细胞运动能力来发挥抗肿瘤的目标的。

但本研究尚属于较为初步的研究,更为深入的机理研究有待下一步继续进行。

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