生物芯片扫描仪弱信号检测方法

一、引言

所谓生物芯片，就是利用微加工技术并结合有关的化学合成技术，将大量探针分子固定于载体（如玻片、硅胶芯片、高分子材料制成的薄膜等），然后与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的分布及强弱，对靶分子的序列和数量进行分析检验的微型器件。

生物芯片扫描仪则是通过检测杂交信号并把测定结果转变为可供分析、处理的图像数据，从而对生物芯片进行分析的一种扫读装置。杂交信号的检测是生物芯片扫读的第一步，对后续的数据提取及图像分析将产生重要影响，也直接影响芯片的分析结果。

正因如此，杂交信号的检测成为生物芯片技术向前发展的主要困难之一，而且随着芯片集成度的提高，使用的反应样品量越来越少，产生的信号越来越微弱，对检测系统的要求也就越来越高，必须满足很高的检测灵敏度、高信噪比及大动态范围。

此外，为提高检测效率，适应快速扫描，对检测系统的响应速度也提出了更高的要求。

二、信号检测方法的分类及比较

随着生物芯片制造技术的蓬勃发展，与之相应的信号检测方法也迅速发展起来。

根据生物芯片相对激光器及探测器是否移动来对生物芯片进行扫读，有扫描检测和固定检测之分。扫描检测法是将激光器及共聚焦显微镜固定，生物芯片置于承片台上并随着承片台在X方向正反线扫描和Y方向步进向前运动，通过光电倍增管检测激发荧光并收集数据对芯片进行分析。

激光共聚焦生物芯片扫描仪就是这种检测方法的典型应用，这种检测方法灵敏度高，缺点是扫描时间较长。固定检测法是将激光器及探测器固定，激光束从生物芯片侧向照射，以此解决固定检测系统的荧光激发问题，激发所有电泳荧光染料通道，由CCD捕获荧光信号并成像，从而完成对生物芯片的扫读。

CCD生物芯片扫描仪即是由此原理制成。这种方法制成的扫描仪由于其可移动；部件少，可大大减少仪器生产中的失误，使仪器坚固耐用，但缺点是分辨率及灵敏度较低。

根据生物芯片所使用的标记物不同，相应的信号检测方法有放射性同位素标记法、生物素标记法、荧光染料标记法等。其中放射性同位素由于会损害研究者身体，所以这种方法基本已被淘汰。

而生物素标记样品分子则多用在尼龙膜作载体的生物芯片上，因为在尼龙膜上荧光标记信号的信噪比较低，用生物素标记可提高杂交信号的信噪比。目前使用最多的是荧光标记物，相应的检测方法也最多、最成熟，主要有激光共聚焦显微镜、CCD相机、激光扫描荧光显微镜及光纤传感器等。

本文主要介绍激光共聚焦及CCD生物芯片扫描仪的弱信号检测方法。

三、激光共聚焦生物芯片扫描仪弱信号检测方法

3．1 特点

激光共聚焦生物芯片扫描仪以激光作为激发光源，能产生强度较高的发射荧光，可大大提高检测灵敏度。

目前此类仪器多采用2种或2种以上不同波长的激光器作为激发光源，以激发不同荧光染料标记的靶分子，通过荧光光密度比来减少或消除测定时某些干扰引起的实验误差，提高实验的可靠性，采用有较宽光电响应动态范围的光电倍增管作为光电耦合器件对弱光信号进行检测，有很高的检测灵敏度，可检测每平方微米零点几个荧光分子。

这种检测方法灵敏度和分辨率很高，图像质量好，但扫描时间较长，比较适合大规模生物芯片杂交信号的检测，可广泛应用于基因诊断、基因表达等方面研究。

3．2技术方案

设计原理框图见图1。

具体方法是：杂交后的芯片经处理后固定在由计算机控制的二维移动平台上，激光器发出的激光经物镜聚焦在生物芯片上，标记有荧光染料的靶分子在激光的激发下产生荧光，通过同一物镜收集荧光信号后，经窄带干涉滤光片，滤除发射荧光以外的光，再由透镜聚焦于小孔光阑。光阑的光孔设计很小，使芯片上的灰尘或杂光不能通过光孔聚焦在光阑上，以此阻挡大部分激发光焦平面以外的荧光信号，避免了其对检测结果的影响。通过小孔光阑的光信号由光电倍增管检测变成电信号，经放大、滤波、A/D转换等处理后送人计算机，即完成了对一点的测量，再由计算机控制二维移动平台，就可实现对整个芯片的扫读。

光电倍增管是检测系统的核心器件，根椐系统要求选择合适的光电倍增管对提高整个检测系统的性能很关键。为检测微弱荧光信号，需要高灵敏度、高信噪比、大动态范围的光电倍增管。此外，为适应快速扫描，光电倍增管的响应速度也要达到一定的要求。

经光电倍增管转换出来的电信号必须进行预处理，主要是信号放大、滤波、去噪处理等。其中，信号放大采用可控增益放大器或模拟开关及高速运算放大器，用软硬件结合的方法实现通道增益的调节，后者控制更灵活、方便。

A/D转换器也是检测系统的重要部件，功能是将荧光强弱信号转化为数字图像信号。A/D转换器采用12位以上，不超过16位的并行输出高速A/D器件。为提高分辨率希望位数高一些，但还要考虑与单片机的接口和工作速度。

D/A转换器的功能是将数据信号转换成控制电压，调节光电倍增管及运算放大器的增益，以适应检测不同光强的芯片。

信号处理单片机可采用51系列单片机，其主要功能是控制D/A转换器，以实现D/A对主控计算机反馈回来数据的数模转换。此外，若信号预处理部分采用模拟开关及高速运算放大器，单片机还将控制其通道的选择。由于控制过程中没有复杂的运算，而且汇编语言编程的单片机能够实时快速地控制芯片的工作状态，所以51系列单片机完全能满足扫描仪快速扫描的要求。

这种方案设计特点是：要求主控计算机处理功能强大（一般是奔3CPU）；存储的空间大（一般带有数G byte硬盘），以利于图像的存储与发送；可容易地对用户设置的参数进行保存。缺点是各种接口的设计难度较大。按照前述的技术方案，这种仪器的扫描分辨率将达到5μm、探测灵敏度0.1个荧光分子、扫描速度10线、扫描面积22mmx75mm。可以满足芯片研发厂家和使用单位（如医院、制药厂等）的一般要求。

四、CCD生物芯片扫描仪弱信号检测方法

4．1特点

光电倍增管型是通过点成像探测并结合高速XY扫描而实现对生物芯片进行扫读，一般用激光作为激发光源，而CCD型一般不采用激光作为光源，其原因是CCD生物芯片扫描仪是对芯片一次成像进行探测，激发光照射光场为整个芯片区域，若采用激光作为激发光源则激光束光强的高斯分布会使得光场光强度的分布不均，而荧光信号的强度与激发光的强度密切相关，因此不利于信号采集时的线性响应。在实际研究或应用中，为提高CCD芯片扫描仪的检测灵敏度，多采用高强度的氙灯或高压汞灯以提高激发效率。

CCD生物芯片扫描仪以CCD相机作为信号接收器，不像光电倍增管型采用逐点激发荧光探测，而是一次性获得整个生物芯片的杂交谱型，所以不需二维移动平台，大大提高了获取荧光图像的速度，使得这种检测方法扫描时间很短。但对于集成度很高的生物芯片，由于需采用高像素的CCD，会使每个像素的感光量减少，灵敏度和分辨率会相对较低，所以这种方法比较适合中小规模生物芯片的研究和应用，如DNA测序、临床诊断等。

4．2 信号检测原理设计

设计原理框图见图2。

其具体方法是：单色光经激发窄带干涉滤光片滤光后激发荧光标记的生物芯片，产生的荧光信号经发射窄带干涉滤光片由CCD摄像头捕获成像在CCD芯片上，而图像信号由CCD摄像头直接传送到插在计算机PCI插槽中的DSP图像采集卡上，图像采集卡将图像信号转变成数字信号后由计算机存储，可存储为TIFF，GIF，JPEG等多种文件存储格式。对于多种颜色标记的芯片，可自动更换激发干涉滤光片和发射干涉滤光片，再次进行读取。

为适应快速高效地扫描生物芯片的目的，需选择光电转换效率高，特别在波长500～800nm范围转换效率高的CCD。由于荧光信号很微弱，必须采取措施降低背景噪声，提高信噪比。为此，选用半导体致冷的冷却CCD，其最低温度可达零下40℃。此时CCD的灵敏度接近光电倍增管的水平，可大大降低CCD的噪声水平。同时，延长CCD成像的曝光时间也可提高信噪比及灵敏度。

五、结束语

生物芯片的弱信号检测方法多种多样，且各有特点，随着生物芯片向更高密度、更大规模方向发展，信号检测的难度也将随之增大。目前，虽然国内的生物芯片弱信号检测技术还处于起步阶段，与国外差距甚大，但随着生物芯片技术的发展和在诸多领域的广泛应用，生物芯片扫描仪及其弱信号检测技术也必将加快其发展步伐，在未来的生命科学领域发挥更大的作用。