杂交信号的放大

1) 用生物素酰化探针与切片进行杂交、洗涤，进行第一轮杂交信号检测。

对生物素酰化探针信号的放大，可在基本方案步骤8之后的任何一步进行。

2) 如果切片已加盖玻片并密封，可用一针头或解剖刀片划开密封的指甲油，移去盖玻片，并除去载玻片上指甲油。将玻片浸于盛有 0.1% Triton ×-100/4×SSC的，以铝箔包裹的Coplin广口瓶15 min,轻轻摇动。如盖玻片不易松动，应小心抬起，重复洗涤2次。

3) 吸去载玻片上残余溶液，在载玻片上加 50μL的1〜3μg/ml生物素酰化抗亲和素抗体，盖以22 mm²大小的Parafilm 膜，置加湿盒中，湿盒外裹以铝箔，放 37℃温育 30 min。

4) 取掉Parafilm 膜，在 0.1% Triton ×-100/4 × SSC中轻摇洗涤15 min。

5) 吸去玻片上残液，加50μL生物素信号放大溶液，盖以Parafilm膜。放在裹以铝箔的加湿盒中，于37℃温育30 min。

6) 移去Parafilm 膜，并以 0.1% Triton×-100/4×SSC 洗涤 15 min。然后以 4×SSC洗涤15 min,洗涤时应轻轻摇动。可进行亲和素-荧光素和生物素酰化抗亲和素抗体的多层反应，但将会明显地增加本底。

7) 复染，固定并在显微镜下观察