颞叶癫痫模型的建立及其相关研究

颞叶癫痫由于药物治疗的效果较差,成为难治性癫痫中的一大类。以往多采用系统给药的方法建立大鼠海仁酸( kainic acid, KA)颞叶癫痫模型，国内外偶有局部给药制作模型者，但均未对模型本身进行系统研究，同时，所用海仁酸的浓度和剂量等差异较大。

我们用立体定向技术，对海马给药建立大鼠颞叶癫痫模型所需海仁酸的浓度和剂量以及模型的电生理特征和癫痫敏感性永久存在的病理学基础等进行了研究，报告如下。

【材料与方法】

一、材料

1、实验动物:体重250g的健康成年雄性Wistar大鼠。

2、实验仪器:海仁酸、立体定向仪、WZ250型微量注射机、ML118型脑电图仪、1720Digital型Leitz冰冻病理切片机。

二、方法

1、模型建立: 10%水合氯醛1ml腹腔注射麻醉后，将大鼠固定于立体定向仪上。75%的酒精消毒处理，沿头顶部正中线切开头皮。确定海马CA3中心点三维座标: X = 25. 3 mm, Y = 4. 0 mm, Z = 26. 0 mm，即海马区给药点。

首先使定位针的尖端位于三维座标系的H点，其座标为: X = 25. 3 mm, Y = 4. 0mm, Z = 0 mm，颅骨钻孔H点。第二步，在微量注射器内抽入0. 4μg/μl的海仁酸2. 5 μl。使Z轴的座标为26. 0 mm,即向下进针达CA3中心点。

第三步，使2. 5 μ l的海仁酸在10 min内缓慢匀速地注射完毕，留置3min后退出注射针。然后，全层缝合头皮。对手术后大鼠的行为学进行观察并摄像记录。

2、脑电监测:于癫痫发作后6 h、1 d、3 d、5 d、7 d之后每周1次取2只癫痫鼠，直到术后2个月，进行脑电图检查。麻醉后将其固定在立体定向仪上，注射侧开颅。用三个导联记录，一条电极刺入对侧乳突部头皮下，另一条刺入致癫侧的海马结构，第三条分别置于嗅球、纹状体和大脑皮层,利用脑电图机进行脑电的监测和记录。

3、病理检查:于模型建立后6 h, 1 d, 3 d, 5 d, 7 d之后每周1次抓取2只癫痫鼠，直到术后2个月。麻醉后打开胸腔暴露出心脏。

用1%和4%的多聚甲醛依次通过心脏进行灌注后，断头完整取出脑组织，放入4%的多聚甲醛中进行固定，然后移入30%蔗糖磷酸缓冲液中4℃过夜。在冰冻切片机上切取30μm厚的冠状脑片，进行Nissl染色。

【结果】

一、行为学表现

自海马注入海仁酸后到麻醉清醒约1 h期间，大鼠基本上处于麻醉状态，偶尔出现身体瞬间抖动。在清醒后大约30min内，活动较少，有时有凝视和“湿狗样抖动”(wet-dog shakes) 。清醒30min后，“湿狗样抖动”和凝视逐渐频繁，间或出现口的咀嚼运动。清醒近1h时，大鼠逐渐变得略活跃，口的咀嚼运动和面部抽搐逐渐频繁，并且有大量唾液从口腔流出，同时，双眼裂变大,双眼球向外突出，逐渐出现幅度不断增大的点头运动，间或出现注射对侧前肢的抽搐和搔头动作。清醒约1. 5h后,前肢抽搐逐渐频繁，前肢的抽搐由注射对侧抽搐很快发展到双侧抽搐,抽搐时，前肢向上抬起，身体亦抬起呈半立位，但以注射对侧相对较重。清醒近2h时，在不断重复上述表现的基础上，由前肢剧烈抽搐，发展到身体逐渐强直，呈角弓反张，逐渐出现频繁的双后肢抽搐、后退、向后跌倒和身体旋转跌倒，在较短的发作间期，大鼠表现呆板、呆滞。清醒后3h时，发作频率逐渐下降，发作形式主要为身体强直、双后肢抽搐、跌倒、双前肢抽搐、点头、咀嚼、流涎、面部抽搐等。清醒后5h，发作频率逐渐减少，主要形式为双前肢抽搐、咀嚼、点头、流涎等，发作间期逐渐延长,但发作间期的行为仍然呆板、呆滞。清醒7h时，约10min出现1次发作，主要为双侧或单侧前肢抽搐、点头、咀嚼等，发作间期，大鼠变得略微活跃。清醒8h时，约20 ～30min有1 次发作，表现单侧前肢抽搐、点头等，发作间歇期，活动有所增多，双眼球向外突出逐渐减轻。至清醒后约11h，癫痫发作逐渐停止，活动虽有增多，但仍未达到正常状态。24h后，活动恢复正常。24h至2个月期间，每周出现1～3次发作，主要表现为咀嚼、点头、单侧或双侧前肢抽搐、身体强直等。

二、脑电特征

模型建立后6h，脑电记录的情况为海马的丛集性棘波放电，嗅球、纹状体和大脑皮层未记录到棘波放电。建立后1d，除了海马存在棘波放电外，纹状体和大脑皮层可记录到稀少的与海马棘波同步的棘波放电。建立后3d，除了海马密集的癫痫波外，纹状体和大脑皮层的棘波逐渐增多，同时，在嗅球可记录到癫痫波，这些海马外记录到的癫痫波与海马的棘波具有同步性。模型建立后5d至2个月，在癫痫大鼠的海马、纹状体、大脑皮层和嗅球均可记录到较多的癫痫波，但是这些记录到的癫痫波并不完全同步，模型建立的时间越长，上述区域记录到的棘波放电的同步性就越差。

三、病理学改变

Nissl染色可以见到在海仁酸注射后6h、1d、3d、5d、7d时、海马CA3区域密集的锥体细胞出现逐渐加重的肿胀、变性和崩解。1周后，CA3区域的锥体细胞逐渐减少，注射后3周，在CA3部位的神经细胞几乎完全缺失，同时，有大量的胶质细胞增生聚集成胶质团块。注射对侧的相应区域亦出现类似的病理变化，但出现相对晚些，同时，亦不如注射侧严重。海马齿状回的神经细胞亦逐渐减少。

【讨论】

海仁酸制作癫痫模型可分为系统给药和局部给药，系统给药（8～12 mg/kg体重）为通过皮下、腹腔以及静脉给药，局部给药为通过脑室或海马给药。由于系统给药操作方便，制作简单，因此被广为利用。但是，在应用过程中，系统给药制作癫痫模型的不足也逐渐显现出来。首先，系统注射海仁酸，药物通过体循环后，进入大鼠脑组织内，因此，不同种属、不同个体和不同年龄的大鼠对海仁酸的反应亦表现出明显的不同。相同条件的SD（Sprague-Dawley）大鼠对海仁酸的反应就比同样条件的Wistar大鼠对海仁酸反应迟钝得多，老年大鼠比年轻大鼠对相同剂量的海仁酸要敏感得多。这样就使实验条件的处理和实验研究的设计变得复杂。其次，由于系统给药时，只有不足1%的药物可以透过血脑屏障进入大鼠脑组织中，与脑内的相应受体结合，不难看出其中的浪费。本实验中，利用立体定向技术，海马局部按4μg/kg体重注射海仁酸，建立大鼠颞叶癫痫模型，虽然操作看似复杂，却避免了系统给药的不足。Racine提出了癫痫大鼠行为学的分级标准，其标准为: Ⅰ级，咀嚼、眨眼、立须等面部肌肉抽搐; Ⅱ级，以点头运动为主的颈部肌肉的抽搐; Ⅲ级，单侧前肢的阵挛、抽搐; Ⅳ级，双侧前肢阵挛、抽搐伴身体立起;Ⅴ级，双侧后肢强直、身体背曲强直、跌倒。在本实验中，大鼠经历癫痫前频繁的“湿狗样抖动”之后，即进入级发作状态，很快进入级发作状态，同时， Ⅰ级和Ⅱ级发作状态会有交叉，之后进入Ⅲ级发作状态，很快即进入Ⅳ级发作状态， Ⅲ级和Ⅳ级发作状态也有交叉，然后，大鼠的癫痫发作进入Ⅴ级状态。整个的点燃过程经历了从Ⅰ级到Ⅴ级的发作，点燃成功后，癫痫大鼠每周出现1～3次Ⅰ级到Ⅳ级的发作，具有癫痫长期敏感性。从发作形式上看，模型模拟了人类颞叶癫痫从“口唇的自动症、涎涎分泌等植物神经症状、头部的自动症”到“单侧上肢的抽搐、双侧上肢的抽搐”，最后扩展到“下肢阵挛、身体强直阵挛”的全部发作过程，发作形式与人类颞叶癫痫极为一致。本模型中，海马CA3区的锥体细胞和海马齿状回的神经细胞在海仁酸注射后，伴随着癫痫发作，逐渐缺失减少，最后CA3区域的神经元几乎全部缺失。海仁酸是从日本的一种天然海藻中提取的兴奋性氨基酸- 谷氨酸的结构类似物，注射后，其与海马齿状回中颗粒细胞轴突末梢上的海仁酸受体结合，增加突触末梢膜的通透性，使颗粒细胞中兴奋性神经递质2谷氨酸大量释放、重吸收减少，引起突触后神经元2海马域锥体细胞的过度兴奋毒性，连同谷氨酸本身对CA3区域锥体细胞的兴奋毒性作用，使CA3区域锥体细胞逐渐减少甚至完全缺失。海马齿状回中有大量的中间神经元，包括γ2氨基丁酸能神经元，这些中间神经元联系广泛，代谢活跃，因此对氧的变化非常敏感。每一次癫痫发作均会使脑组织出现乏氧的情况，使海马齿状回中的中间神经元因缺氧而出现水肿、变性甚至死亡，因此，在模型中，可以观察到齿状回神经元的逐渐减少缺失。此外，尚可观察到神经元缺失的区域出现胶质细胞增生，形成胶质团块。这样的病理改变同人类颞叶癫痫的病理变化2海马硬化极其一致。成功的癫痫模型，其发作形式和脑电活动必须与人类一致，至少要有脑电的癫痫改变。本模型，棘波放电起源于一侧海马，然后迅速在边缘系统中传播扩布，并可扩布到全脑的皮层，引起相应的一次颞叶癫痫发作。其异常电活动的形式与人类颞叶癫痫也是一致的。海仁酸颞叶癫痫发作具有长期的癫痫敏感性。首先，海仁酸本身的神经兴奋毒性和其引起的传导性神经兴奋毒性使海马内的兴奋2抑制平衡遭到破坏，引发癫痫发作，造成海马神经元的减少、缺失以及随后的胶质细胞增生。其次，在海马神经元的减少中，齿状回中以γ2氨基丁酸能神经元为主的抑制性中间神经元的减少又使海马内的兴奋2抑制平衡进一步破坏，这样，海马神经元的减少和缺失便从癫痫发作的结果变成了再次癫痫发作的原因，如此以来，兴奋-抑制平衡的破坏和海马神经元的减少缺失便互为因果，形成一个有始无终的发作环路，使癫痫发作永久存在，使模型具有长期的癫痫敏感性。因此，海马神经元的缺失和胶质细胞的增生是癫痫敏感性永久存在的病理学基础。