affymetrix芯片实验步骤－中文版
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目 录
第一章 总 RNA 的纯化（ RNeasy ® Kit ） .................. ..... ...... 3
第二章 由 RNA 合成双链 DNA .............................................. 4
一、反转录合成第一链 cDNA ............................................ 4
二、反转录合成第二链 cDNA ............................................ 5
第三章 生物素标记 cRNA 合成 ............................................. 6
三、体外转录合成标记 cRNA ............................................ 6
四、 aRNA 纯化 .................................................................. 6
第四章 杂交、洗涤、染色、扫描芯片 ......................... .. ....... 8
五、片断化 ........................................................................... 8
六、杂交 ............................................................................... 8
七、洗涤、染色和扫描 ....................................................... 9
第一章 总 RNA 的纯化（ RNeasy ® Kit ）
通常在使用TRIzol 法抽提组织总 RNA 时，因为方法的限制，造成总 RNA 的纯度降低，影响探针的标记和芯片杂交。所以需使用 QIAGEN RNeasy Kit 进一步的纯化。详细操作原理和方法见 Rneasy Mini Protocol for RNA Cleanup 。
1. 根据需纯化的样品数配制DNase I 混合液，每个样品需要 80 μL的 DNase I 混合液，按 10 μL DNase I的储存液加入 70 μL Buffer RDD配制。
2. 取经质检合格的总RNA≤100 μg溶解于 100 μL RNase-free的水中，再加入 350μL Buffer RLT 并充分混匀
3. 加入250 μL无水乙醇， Tip 头充分混匀。
4. 将共计700 μL含总 RNA 的溶液转入套在 2 m L 离心管内的RNeasy mini 柱子内， 8,000 g离心 15 ~ 30 s， 弃去滤过液。
5. 加350 μL Buffer RW1到离心柱内。盖上管盖， 8,000 g离心 15 s，弃去滤过液。
6. 直接加入DNase I 混合液（ 80 μL）到离心柱膜上，室温放置 15 min 。
7. 加350 μL Buffer RW1到离心柱内。盖上管盖， 8,000 g离心 15 s，弃去滤过液。
8. 吸取500 μL Buffer PRE到 RNeasy mini 柱子内， 8,000 g离心洗涤 15 s ，弃去滤过液，再用500 μL Buffer PRE在 8,000 g离心洗涤 2 min ，弃去滤过液和2 m L 套管，将RNeasy mini 柱子转入一新的 1.5 m L Eppendorf管中。
9. 吸取40 μL RNase free的水， ≥8000 g离心洗脱 1 min 。
10. 重复步骤9 一次。
11. 测定OD 值（通常 OD 数值在 1.8 ~ 2.1之间）
第二章由 RNA 合成双链 DNA
一、反转录合成第一链 cDNA
1 、准备 Poly-A Control
按下表稀释 Poly-A Control ：
表 1.1
起始总 RNA 量 | 连续稀释 | 加到样品中体积 | |||
1 | 2 | 3 | 4 | ||
50 ng | 1 ： 20 | 1 ： 50 | 1 ： 50 | 1:20 | 2 μL |
100 ng | 1 ： 20 | 1 ： 50 | 1 ： 50 | 1:10 | 2 μL |
250 ng | 1 ： 20 | 1 ： 50 | 1 ： 50 | 1:4 | 2 μL |
500 ng | 1 ： 20 | 1 ： 50 | 1 ： 50 | 1:2 | 2 μL |
2 、准备总 RNA/Poly-A RNA Control 混合液
在冰上按照下表准备总 RNA/Poly-A RNA Control 混合液。
表 1.2
Component | Volume |
Total RNA Sample (50-500 ng) | variable |
Diluted Poly-A RNA Controls (Fourth Dilution) | 2 μL |
Nuclease-free Water | variable |
Total Volume | 5 μL |
3 、准备第一链反应混合液
A 、在冰上溶解一链反应试剂
B 、在冰上按照下表准备第一链反应混合液。
表 1.3
Component | Amount |
First-Strand Buffer Mix | 4 μL |
First-Strand Enzyme Mix | 1 μL |
Total volume | 5 μL |
C 、转移 5 μL 准备好的第一链反应混合液到反应管。
4 、加 RNA/Poly-A RNA Control 混合液
A 、转移 5 μL 准备好的 RNA/Poly-A RNA Control 混合液到已经分装好第一链反应混合液的反应管中，至总体积 10 μL 。
B 、轻轻振荡混匀，低速离心收集反应液到管底。
5 、运行反应
A 、在 PCR 仪上运行 42 o C 2 h 。
B 、反应后低速离心收集反应液到管底，放置冰上并立即进行第二链 cDNA 合成反应。
二、反转录合成第二链 cDNA
1 、准备第二链反应混合液
A 、在冰上按照下表准备第二链反应混合液：
表 2.1
Component | Amount |
Nuclease-free Water | 13 μL |
Second -Strand Buffer Mix | 4 μL |
Second -Strand Enzyme Mix | 1 μL |
Total volume | 5 μL |
B 、轻轻振荡混匀，低速离心收集反应液到管底。
C 、转移 20 μL 第二链反应混合液至（ 10 μL ） cDNA 样品管中，混匀，低速
离心收集反应液到管底。
2 、运行反应
A 、在 PCR 仪上运行 16 o C 1 h， 65 o C 10 min 。
B 、反应后低速离心收集反应液到管底，放置冰上并立即进行 IVT 。
第三章 生物素标记 cRNA 合成
三、体外转录合成标记 cRNA
1 、准备 IVT 混合液
A 、在室温按照下表准备 IVT 混合液。
表 3.1
Component | Amount |
IVT Biotin Label | 4 μL |
IVT Labeling Buffer | 20 μL |
IVT Enzyme Mix | 6 μL |
Total volume | 30 μL |
B 、轻轻振荡混匀，低速离心收集反应液到管底。
C 、转移 30 μL IVT 混合液至（ 30 μL ）双链 cDNA 样品管中，混匀，低速离
心收集反应液到管底。
2 、运行反应
A 、在 PCR 仪上运行 40 o C ，时间长度依赖于起始 RNA 投入量，见下表。
表 3.2
RNA Amount | IVT Incubation Time |
50 – 250 ng | 16 hours |
100 – 500 ng | 4 hours |
3 、立即纯化或 -20 o C 保存。
四、 aRNA 纯化
提前在 50 ~ 60 o C 预热 aRNA Elution Solution 10 min以上。
1 、准备 aRNA Binding 混合液。
在室温按照下表准备 aRNA Binding 混合液。
表 4.1
Component | Amount |
RNA Binding Beadundefined | 10 μL |
aRNA Binding Buffer Concentrate | 50 μL |
2 、加 aRNA Binding 混合液
A 、加 60 μL aRNA Binding 混合液到每个样品。
B 、转移样品到 U 型板。
C 、用枪上下混匀几次。
3 、 aRNA Binding
A 、加 120 μL 100% 乙醇到每个样品。
B 、用枪上下混匀几次。
C 、轻轻振荡混匀，≥ 2 min 。
4 、 RNA Binding 磁珠收集
A 、转移 U 型板到磁力架上放置约 5 min 。
B 、小心吸取上清，丢弃，取下 U 型板。
5 、洗涤磁珠
A 、加 100 μL aRNA Wash Solution 到每个样品，振荡 1 min 。
B 、转移 U 型板到磁力架上放置约 5 min 。
C 、小心吸取上清，丢弃，取下 U 型板。
D 、重复 A-C 一次。
E 、剧烈振荡 U 型板 1 min 。
6 、 aRNA 洗脱
A 、加 50 μL 预热的（ 50 ~ 60 o C ） aRNA Elution Solution 到每个样品中，从磁珠上洗脱下纯化后的 aRNA 。
B 、 剧烈振荡 U 型板 3 min 。检查磁珠是否全部混匀，如果没有，继续振荡至磁珠全部混匀。
C 、转移 U 型板到磁力架上放置约 5 min 。
D 、转移上清到一个新的 N uclease-free 管中。
7 、保存 aRNA 在 -20 o C 以下的温度或者放在冰上进行定量和片断化。
第四章 杂交、洗涤、染色、扫描芯片
五、片断化
1 、准备 aRNA 片断化混合液。
表 5.1
Component | 49/64 Format | 100 Format | 169/400 Format |
aRNA | 15 μg (1 to 32 μL) | 12 μg (1 to 24 μL) | 7.5 μg (1 to 16 μL) |
5x Array Fragmentation Buffer | 8 μL | 6 μL | 4 μL |
Nuclease-free Water | Variable (up to 40 μL final volume) | Variable (up to 30 μL final volume) | Variable (up to 20 μL final volume) |
2 、片断化反应。
A 、 94 o C 反应 35 min。
B 、反应结束后立即放置冰上。
3 、电泳检测片断化产物片段大小，约为 35 ~ 200 nt 。
4 、立即进行杂交实验或冻存。
六、杂交
1 、按照下表根据杂交芯片种类准备杂交液。
表 6.1
Component | 49 (Standard) / 64 Format | 100 (Midi) | 169 (Mini) / 400 (Micro) | Final Dilution |
Fragmented and Labeled aRNA | 12.5 μg (33.3 μL) | 10 μg (26.7 μL) | 5 μg (13.3 μ L) | 0.05 μg/ μL |
Control Oligonucleotide B2 (3 nM) | 4.2 μL | 3.3 μL | 1.7 μL | 50 pM |
20X Hybridization Controls (bioB, bioC, bioD, cre) | 12.5 μL | 10 μL | 5 μL | 1.5, 5, 25, And 100 pM respectively |
2X Hybridization Mix | 125 μL | 100 μL | 50 μL | 1X |
DMSO | 25 μL | 20 μL | 10 μL | 10% |
Nuclease-free Water | 50 μL | 40 μL | 20 μL | |
Total Volume | 250 μL | 200 μL | 100 μL |
2 、在室温平衡芯片。
3 、 99 o C 加热杂交液 5 min。
4 、同时加适量（见表 6.2 ）预杂交液到芯片。
表 6.2
Array | Volume |
49 Format (Standard) | 200 μL |
64 Format | 200 μL |
100 Format (Midi) | 130 μL |
169 Format (Mini) | 80 μL |
400 Format (Micro) | 80 μL |
5 、芯片预热 10 min 。
6 、杂交液 99 o C 加热后， 45 o C 放置 5 min。
7 、最大速度离心杂交液 5 min 。
8 、加杂交液到芯片里， 45 o C ， 60 rpm 杂交 16 h 。
七、洗涤、染色和扫描
1 、准备好洗涤工作站和扫描仪。
2 、分别分装 600 μL stain1 ， 600 μL stain2 ， 800 μL Array Holding Buffer ，放置到洗涤工作站的相应位置。
3 、选择相应的洗涤程序，按下软件开始洗涤染色按钮进行洗涤染色芯片。
4 、芯片洗涤染色后放进扫描仪，按下软件开始扫描按钮进行扫描芯片。
