共聚焦成像技术在生物芯片检测中的应用

一、引言

生物工程是21世纪八大支柱产业之一，生物芯片技术被誉为“新世纪生命科学的支撑技术” ，是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。

生物芯片技术是20世纪90年代初半导体技术和生物技术“联姻”的结晶，是微电子学和生命科学结合产生的高科技杰作，由于它广阔的应用前景和强劲的发展势头，必将给传统医学带来一场新的革命。

生物芯片技术的开发与运用涉及生物学和医学基础研究、农业、疾病诊断、新药开发、食品、环保等领域。就像当年的半导体技术一样，生物芯片技术将成为社会和经济发展的排头兵，成为新世纪最大的高新技术产业。

我国在生物芯片研究方面刚刚起步，1998年10月，中科院将基因芯片列为“九五”特别支持项目，利用中科院在微电子技术、生化技术、物理检测技术方面的优势，组织跨所、跨学科合作。

生物芯片是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。作为生物芯片技术四大环节之一的生物芯片检测技术在生物芯片技术发展中扮演着重要的角色。

一批新生的生物芯片仪器公司如雨后春笋，随之发展起来。生物芯片待测微量荧光信息具有信号微弱、排列密度较高的特点，使用共聚焦成像方法是其最佳的检测方法。

二、共聚焦成像原理

共聚焦成像技术指将激发光源发出的光聚焦在样本上的某一点，激发荧光，光学系统又将这一点散射出的荧光光子精确地聚焦在针孔空间滤波器（SF）上，即样本和针孔滤波器同步聚焦。探测器在针孔滤波器的后方，因此只能探测到从样本探测区域内发射出来并聚焦在针孔滤波器内的荧光光子。如图1。

共聚焦成像技术与其他非共聚焦成像相比，关键在于针孔空间滤波器。样片上理想探测区域发出的荧光经荧光收集物镜，成为一道近平行的光束，它的空间频率很低，甚至是零，经成像物镜聚焦于光轴焦点上，能很容易地通过置于焦点上的针孔空间滤波器。

而光束中混入的杂光的空间频率较高，经成像物镜后聚焦于离焦点很远的地方，因而无法通过空间滤波的针孔。针孔滤波器的直径d与透镜的孔径D、透镜的焦距f 、成像波长λ有关。有经验公式

物镜的孔径越大，针孔的孔径越小，成像质量越好。

共聚焦成像原理如图1所示，在样片上方或样片下方超出物镜焦深范围的点，被激发的荧光通过系统聚焦于针孔空间滤波器的前方或后方，被滤波器滤掉而不能被探测器所探测，只有在其焦深范围内的荧光信号才能通过空间滤波器进入检测器。

因此，其探测到焦点外的信号强度要比在焦点内的信号强度弱很多。共聚焦成像系统不但具有很好的横向分辨力，也具有更为出色的纵向深度的分辨能力，系统的焦深很小，通过空间滤波器可以显著减少样本点以外的荧光信号的收集率，明显降低背景噪声，提高信噪比，进一步提高了成像质量。

非共聚焦成像系统则不具备以上特点，其成像系统具有明显的缺陷，只有通过增改原始数据、牺牲原始有效信号等手段消除背景噪声，提取有效信号，来弥补非共聚焦光路的不足，同时不可避免地降低了系统的灵敏度。

成像系统的灵敏度与物镜对光子的收集效率直接相关，物镜的数值孔径对光子采集率的影响是非线性的，光子采集效率CE=arcsinNA/360×100%，如图2。

大多数物镜系统受技术限制，物镜数值孔径仅为0.30，光采集效率为2.3%。一般CCD成像系统所使用的物镜镜头数值孔径均低于0.25，而共聚焦成像系统物镜的数值孔径可达到0.7～0.8，收集效率为15%～20%。光子收集效率是一般CCD成像系统的7～10倍。

三、应用

激光共聚焦生物芯片扫描仪采用共聚焦成像技术，以激光作为激发光源。激光发出的光束经过整形、扩束、准直和窄带滤波后，通过分束器进入聚焦物镜，被聚焦物镜聚焦于待测样片上。激发的荧光信号被收集物镜收集后，通过窄带滤波，被成像物镜聚焦后进入针孔空间滤波器，最后被探测器（PMT）探测。荧光收集物镜前的焦点和成像物镜后的焦点构成一对共轭焦点，和针孔空间滤波器一起构成了共聚焦成像系统。

激光共聚焦生物芯片扫描仪采用双波长激发光源，聚焦光斑5μm，荧光收集物镜数值孔径为0.75，样片步进扫描，达到了高的扫描成像分辨率和高的荧光收集效率。

图3，4为中科院光电所研制的SCAN-2激光共聚焦生物芯片扫描仪50μm和5μm分辨率扫描标准样片的扫描图像。

仪器实际检测的技术指标如下：
　　扫描样片尺寸：22mm×70mm
　　激发波长：532nm，544nm，635nm
　　发射波长：500nm，700nm
　　像素与分辨率：5μm，10μm，20μm，100μm
　　灵敏度：0.15荧光分子/μm²
　　扫描速度：6min/片

　

为了适应多种材料的样片，包括玻璃、塑料、反射性金属、膜等，SCAN-2激光共聚焦扫描仪具有激发光强度和发射光增益调节的功能，以适应不同材料、不同背景下的信噪比要求。

四、结论

随着生物信息技术的发展，共聚焦成像技术将会得到广泛的应用。SCAN-2激光共聚焦生物芯片扫描仪整机的性能及技术指标已经达到国内外相当水平。