实验动物的遗传质量检测技术

目的与要求

1、掌握小鼠尾部皮肤移植的方法，准确判断移植皮片的接受与排斥。

2、学习与掌握异构蛋白与同工酶的醋纤膜(板)电泳技术，了解不同近交系小鼠生化标记特征。

仪器与材料

小鼠、电子称、1ml一次性注射器、0.5%戊巴比妥钠、碘酒、棉球、手术刀、弯尖剪、眼科镊、平皿、消毒纱布、记号笔、创可贴、试管、铅笔、醋酸纤维膜、竹夹、微量注射器、琼脂、显色液、漂洗液、透明液、缓冲液、染色液、7%冰醋酸、电吹风、玻璃板、点样板、采样板、电泳槽、电泳仪、温箱。

内容

一、尾部皮肤移植法

这是目前最常用和最灵敏的检测亚系内或亚系间组织相容性基因差异的方法。在小鼠和大鼠中普遍采用的是尾部或背部皮肤移植法。皮肤移植法灵敏度高、易掌握、经济、不需昂贵设备、易对植皮成活作出估计，对移植创伤具有相对抗力、可检测出许多H基因、并能有效地测出新发生的、造成亚系变异的遗传混杂和突变。

但也有许多缺点：

（1）费时费力，为检测非H-2组织相容性基因的差异需观察100天；

（2）饲养动物需较大的空间；

（3）某些植皮损失可能是由技术或其它非免疫因素造成的；

（4）不是鉴别新形成品系的理想方法。

小鼠尾部皮肤移植法的步骤：

1、将待检动物编号、称重。

2、麻醉。按每千克体重30mg腹腔注射3%戊巴比妥钠，麻醉后，固定好小鼠。

3、在距尾根1cm处用碘酒消毒，再用酒精脱碘，用手术刀在尾部背面尾静脉两侧作长5-6mm的两平行切口，两切口相距3mm，然后用弯尖剪在两切口下端与尾部呈15-20°角剪一横切口，用眼科镊小心地将皮片撕开，在两切口上端剪下皮片，放入消毒平皿中，在该创口下5mm处，用上述方法再取下1片尾部皮肤。

皮片的厚度以不造成严重出血为宜。

4、如此在每只鼠上取下两块皮片，第1只鼠皮片编号近端为1、远端为2，第2-第6只鼠用同样方法编上3、4、……11、12号，在平皿中顺序放好。

5、远端皮片移入自体鼠尾近端创口(自体移植)，即2→1、4→3、……，近端皮片移入异体鼠尾远端创口(交叉移植)即1→4、3→6、……。移植时将移植皮片与受体被毛(尾毛)呈相反方向放在创口上、铺平，用消毒纱布轻轻挤压出移植上皮片下的空气和多余的液体，使皮片与受体皮下组织紧密相贴。

6、在移植皮片外敷以半块创可贴，缠绕两圈。

7、24h后，剪去创可贴，此时皮片已贴在创口上，若皮片错位，应更换创可贴再缠绕一次。

8、观察20天左右，移植皮片表面将长出新的逆向尾毛，如发生急性排斥反应，则创口处出现无毛瘢痕。

9、观察100天以上，存活皮片始终有逆向尾毛，排斥皮片则尾毛逐渐稀疏，直至无毛。

二、小鼠生化标记基因监测的原理

通过多种形式的电泳和电聚集，可检定生化标记即同功酶或蛋白质，常用的电泳介质有乙酸纤维素膜、淀粉凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。每一种标记系统都需要将缓冲液、温度、时间、电压和电流调整到最佳值，并作特异性染色，最后将得到的带型与公布的生化遗传图式进行比较。

小鼠生化标记基因监测步骤：

1、样品处理：将试管按血清样品、血浆样品、血液样品、组织匀浆样品和尿液样品分类、编号，每只鼠在每类样品中编号相同，将处理后的样品放入试管中。

2、点样：

(1) 取一张醋酸纤维膜(6-8cm)确定光、毛面，在毛面上距边2cm处用铅笔做一标志性平行线。

(2) 浸膜：用竹夹子将膜在液中浸透，注意避免膜上出现气泡，取出浸透后的膜并夹在两层滤纸中，吸干余液。

(3) 用微量注射器，将试管中的样品滴入采样板上，每滴一个样品，微量注射器在蒸馏水中清洗3次后再采下一个样品。

(4) 将醋酸纤维膜标志面向上，置于点样板上。

(5) 用采样器在采样板上采样后，再在点样板的醋酸纤维上点样，每点一次，样量为0.3μl，通常点2次。

3、电泳：用竹夹子将点样的薄膜平贴在阴极端电泳槽支架的滤纸桥上(点样面朝下)，另一端平贴在阳极端支架上。

要求薄膜紧贴在绷直的滤纸桥上，中间不能下垂。如一电泳槽中同时安放几张薄膜，则薄膜之间应相隔几毫米。盖上电泳槽盖，使薄平衡10min。接通电泳槽。电泳仪的正、负极，注意电泳条件和泳动方向，不要接错。在室温下电泳，在电泳扩展开25-35后关闭电源。

4、染色方法：

(1) 醋纤膜直接染色法 多用于蛋白类如血红蛋白、白蛋白的电泳染色。电泳后取出纤维膜，在染色液中染10-15min，再用漂洗液(7%冰醋酸)浸洗数次，脱色，直至背景无色，电泳区清晰可见，取出放在滤纸上，再用风机吹干。

(2) 醋纤膜酶显色板法 多用于同工酶类的染色。即用3ml2%琼脂(50℃)与2ml显色液迅速混匀，均匀倒置在6cm×8cm的玻璃板上，制成酶显色板上(注意膜与板之间气泡应排尽，但不能移动膜的位置)，移入37℃温箱，保温显色，至酶区带清晰时取下显色的膜浸入漂洗液中漂洗数次后，取出，干燥方法同前。

5、透明：待膜完全干燥后浸入透明液中3-5min，取出平贴于玻璃板上，完全干燥后即成透明的膜，其可用于光密度计上比测或作标本永久保存。国产醋纤膜建议选用无水乙醇：乙酸乙酯：冰乙酸=83：2：15为透明液，透明时间：30-40s。

6、结果判定：每一品系通过电泳的结果，将它们的位点排列整理，列出带型图并与各品系标准带型图进行对照。

标出相同与不同的生化标志，从而判断被监测品系的纯合度时，若一个品系两个或两个以上的位点发生变异，或在一个位点上出现杂合子，可以判断该品系已发生遗传污染。

若一个品系在某个位点上的基因发生改变，而与该基因相邻的两个基因仍保持不变，或再进一步检查证明其它染色体的位点也未发生变化，则可认为基因的变化是由于突变所致。