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植物遗传多样性检测

相关实验:植物遗传多样性检测

最新修订时间:

简介

遗传多样性是生物在长期进化过程中形成的历史产物,是生物多样性的重要组成部分。一个物种遗传多样性的大小决定了该物种对环境变化的适应能力和进化潜力。对物种遗传多样性的研究可以揭示物种或种群的进化历史,也能为进一步分析其进化潜力和未来命运提供重要科学依据,尤其有助于物种稀有或濒危机制的探讨。近年来,各种分子标记已经被快速应用于植物遗传多样性的研究,包括限制性片段长度多态性(RFLP)、简单重复序列区间多态性(ISSR)、扩增片段长度多态性(AFLP)和简单序列重复多态性(SSR)等。其中,SSR分子标记以其数量丰富、可靠性高、重复性好和共显性遗传等特点,已被广泛应用于植物遗传多样性、系统发育、种质鉴定、遗传图谱构建和基因定位等方面。

材料与仪器

器材:

党参[Codonopsis pilosula(Fr.)Nannf]3 个群体植物的幼嫩叶片,置于变色硅胶中干燥保存。

器具:

① 台式高速冷冻离心机

② 9700 PCR 扩增仪

③ 离心管

④ 各种型号的移液枪

⑤ 水平电泳仪

⑥ 垂直电泳仪

⑦ 凝胶成像仪

⑧ 微波炉

⑨ 高压灭菌锅

⑩ 冰箱

试剂:

① PCR 扩增试剂 dNTP

② Taq DNA 聚合酶

③ 引物等购自生工生物工程(上海)有限公司,其他化学试剂为进口或国产分析纯试剂。

步骤

植物遗传多样性检测的基本过程可分为如下几步:

SSR 标记技术主要包括 DNA 提取、PCR 扩增、电泳检测、结果统计,以及数据分析等步骤。

1. 引物选取

本实验引物是根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)公布的序列设计,由上海 Sangon 公司合成。对党参的每个种群选取 3 个样品,选择 8 个扩增良好、具有多态性的引物进行 SSR-PCR 反应。

2. PCR 体系

总体系 20 μL,包括 10 × PCR Buffer 2.0 μL,每种 dNTP 3 mmol/L,模板 DNA 50 ng,1 单位(U)Taq DNA 聚合酶,正、反引物各 1.0 μL,无菌水 16.4 μL。PCR 程序为:94 ℃ 预变性 4 min,35 个循环包括 94 ℃ 变性 30 s,50~56 ℃(每个引物的退火温度不同,根据具体情况设定)退火 30 s,72 ℃ 延伸 40 s,最后 72 ℃ 终延伸 4 min。反应完成后,用 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物。

3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳

1)电泳程序

(1)灌胶:将清洁干净的大、小玻璃板组装到制胶架上,注意玻璃板要安装正确,玻璃板底部保持在一个平面上,防止灌胶时漏液。用 ImL 移液器向两玻璃板之间小心加入配制好的凝胶液至胶板上部,小心插入梳子,防止气泡的产生,凝聚 0.5 h 左右。

(2)电泳:从制胶架上取下凝好的胶,在自来水下面冲掉外面多余的残渣,将其正确安装到垂直电泳仪上,取适量 1 × TBE(由 10 × TBE 稀释)加入正负极槽中,小心拔出梳子,注意不要使胶孔变形,用 1 mL 移液器吹打胶孔,清除里面的杂质,每个加样孔加入 9 μL 经变性的 DNA 样,每块胶留一孔加 8 μL 50 bp Ladder Marker(3 μL 的原液 + 5 μL 的 3 × Loading Buffer),18 mA 电泳 40~60 min,待漠酚蓝刚好至玻璃板下沿,若目的片段较大可将漠酚蓝跑出玻璃板。

2)银染

(1)固定:小心分开两块玻璃板,将凝胶置于 14 cm 培养皿中,加入适量 25% 乙醇,摇床固定 5 min 左右,此时胶已完全脱离玻璃板。

(2)水洗:将凝胶置于适量蒸馏水中,摇床漂洗 lmin。

(3)氧化:将凝胶置于适量 1% HNO3 中,摇床漂洗 4~6 min,蒸馏水冲洗 2~3 次。

(4)染色:将凝胶置于适量新配 2%。AgNO3 溶液中,染色 20~30 min,用蒸馏水冲洗一次。

(5)显影:加入 100 mL 新配的显色液中,轻轻摇荡至条带完全出现。

[显色液:3 g 碳酸钠(Na2CO3)加水至 100 mL,再向其中分别加入 200 μL 的甲醛和 10 μL 硫代硫酸钠(NazSzCh,16 mg/mL)]。

(6)定影:将显出条带的凝胶置于适量 10% 乙酸中,轻轻摇晃 1 min 左右,用自来水冲洗掉残余乙酸,保存,拍照,进行条带分析。

4. 数据处理

通过 UVI Photo MV 软件对电泳条带进行分析,得出 8 对引物在各居群之间存在明显的 DNA 长度多态性,再利用 GENEPOP version 3.4 对明显具有多态性的引物条带进行分析。具体计算:等位基因数(Aa);期望杂合度(He);观测杂合度(Ho);观测等位基因数(Na);有效等位基因数(Ne);多态位点信息含量(PIC);香农信息指数(I)和基因分化系数(Fst)等。再利用 NtsysPC 2.10 进行 UPGMA 聚类分析。

来源:丁香实验

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