材料与仪器
细胞
EcoRI 酶
SGII 培养基
EcoRI 酶
SGII 培养基
步骤
1. 500 ml 烧瓶中装 250 ml SGII 培养基，在通气和恒定光照条件下，培养细胞至 5X106 /ml 密度。
2. 用 EcoRI 酶切质粒。
3. 去细胞壁，低速离心浓缩细胞，在 SGII-NO3 培养基重悬细胞为 109 个/ml。
4. 将细胞放入灭菌烧瓶中，刚好盖上瓶底，在亮光下轻摇 4 个小时。
5. 转化时，将细胞稀释到 1.7X108 个/ml，取 0.3 ml 加入装有 0.3 g 玻璃珠的 15 ml 带塑料帽的圆锥形离心试管中。
6. 加入灭菌 PEG 溶液，终浓度为 5%。
7. 立即加入 1 μg 线性化的 pMN24 DNA，用旋转混合仪最高速度旋转混合 45 秒。
8. 立即加入 10 ml SGII-NO3 培养基稀释交配混合液，将细胞倒入一干净的 15 ml 试管中，用桌面医用离心机沉淀离心。
9. 留 0.3 ml 培养基，重悬细胞，涂布在 SGII-NO3 培养基的 1% 琼脂平板上。
10. 平板放在恒定的光照下孵育 5~8 天。
11. 通常转化后孵育 8 天，克隆可用肉眼观察到时，用灭菌牙签将单个克隆转到多孔皿上含少量 SGII-NO3 培养基的单个孔中过夜培养。
12. 在选择培养基平板上划线，分离转化的纯克隆。
2. 用 EcoRI 酶切质粒。
3. 去细胞壁，低速离心浓缩细胞，在 SGII-NO3 培养基重悬细胞为 109 个/ml。
4. 将细胞放入灭菌烧瓶中，刚好盖上瓶底，在亮光下轻摇 4 个小时。
5. 转化时，将细胞稀释到 1.7X108 个/ml，取 0.3 ml 加入装有 0.3 g 玻璃珠的 15 ml 带塑料帽的圆锥形离心试管中。
6. 加入灭菌 PEG 溶液，终浓度为 5%。
7. 立即加入 1 μg 线性化的 pMN24 DNA，用旋转混合仪最高速度旋转混合 45 秒。
8. 立即加入 10 ml SGII-NO3 培养基稀释交配混合液，将细胞倒入一干净的 15 ml 试管中，用桌面医用离心机沉淀离心。
9. 留 0.3 ml 培养基，重悬细胞，涂布在 SGII-NO3 培养基的 1% 琼脂平板上。
10. 平板放在恒定的光照下孵育 5~8 天。
11. 通常转化后孵育 8 天，克隆可用肉眼观察到时，用灭菌牙签将单个克隆转到多孔皿上含少量 SGII-NO3 培养基的单个孔中过夜培养。
12. 在选择培养基平板上划线，分离转化的纯克隆。
来源：丁香实验
