实时PCR原理探针翻译

1 、实时PCR原理

对扩增产物进行可重复性的定量长期以来一直是科学家和研究者的目标。传统的方法需要对终产物进行凝胶电泳分析。

这种方法可以确定目的产物和竞争产物的大小，估算纯度，计算条带强度。然而，所用扩增试剂和体系的变动会造成扩增的终产物的重复性有较大的变动，成为这种方法的主要弊端.

扩增过程的指数期提供给我们最有用的，可重复的数据。在起始的目的DNA量与循环过程的指数期的扩增产物量之间存在着定量关系。这正是实时扩增的基础。

随着DNA内嵌染料和探针特异性化学的发展，实时探测量子学的跳跃发展推动了对扩增过程的研究进展。

今天的实时设备由荧光读数计和热循环仪组成，用来监测循环过程的荧光。与实时设备相连的计算机收集荧光数据。数据通过开发的实时分析软件以图表的形式显示。

在扩增的每个循环中至少收集一次荧光数据来进行扩增的实时监控。用户能够根据一个一个的循环知道那个样品正在扩增。这些即时的数据允许用户看清楚各个样本相对于标准品，阳性对照和阴性对照是如何扩增的。用户不仅能在扩增过程中监督整个反应，还可以根据反馈的信息来优化相应程序。因此增加了敏感性，特异性和有效性。

原始数据收集后可以开始分析。实时设备的软件能使收集到的数据进行正常化处理来弥补背景荧光的差异。正常化后可以设定域值水平，这就是分析荧光数据的水平。

样品到达域值水平所经历的循环数称为Ct值（限制点的循环数）。域值应设定在使指数期的扩增效率为最大，这样可以获得最准确，可重复性的数据。如果同时扩增的还有标有相应浓度的标准品，线性回归分析将产生一条标准曲线，可以用来计算未知样品的浓度。

2、 探测化学物质

有5种主要类型的探测化学物质用于实时扩增，包括：

2.1 内嵌染料

2.2 双标记探针

2.3 FRET探针

2.4 分子信标

2.5 Ampliflor

2.1内嵌染料（Sybr-Green I ）

内嵌染料，例如Sybr-Green I ，能与双链DNA结合

　　1 SG不与单链DNA结合，荧光信号强度较低

　　2 SG与双链DNA结合，荧光信号强度极大的增强

SG是一种荧光染料，能结合到DNA双螺旋的小沟。处于溶解状态的未结合染料显示低的荧光强度，一旦结合到双链DNA之后荧光信号增强。这种特性被利用在实时扩增中。由于在扩增反应中DNA增加，染料结合到扩增产物上，荧光信号增强。

荧光信号相对背景水平的增加进行分析。根据扩增子的长度有多个荧光染料的分子结合到双链DNA上。内嵌染料可以和所有其他传统扩增成分，例如水，缓冲液，MgCl2，dNTPs,Taq-聚合酶，引物和模板一起加到扩增反应管中。

因为不需要设计序列特异性探针和新的引物对，这种方法是一种简便，性价比较高的实时监测方法。

内嵌染料没有序列特异性，可以结合到包括非特异产物和引物二聚体在内的任何dsDNA上，因此有必要区分目标信号和假信号。内嵌染料可以在反应末尾对扩增产物进行溶解，称为溶解曲线分析。在溶解曲线分析过程中，随着温度从低于产物溶解点缓慢升到高于产物溶解点，实时仪器连续监测每个样品的荧光值。基于产物长度和G/C含量的不同，扩增产物会在不同的温度点解链。随着产物的解链，可以看到荧光值的降低并被仪器所测量。对溶解曲线进行微分可以计算出溶解峰。

溶解峰反映了反应中扩增到的产物。这些峰是凝胶电泳中条带的类似物。因此，用溶解曲线数据对SG反应后的产物进行质量监督。

2.2 双标记探记

双标记探针是一种短的寡核苷酸序列，5‘末端连接有荧光报告染料，3‘端连接有
荧光淬灭分子。由于这种探针只有15-25bp长，报告基团和淬灭基团紧密接近，几乎探测不到荧光信号。在循环过程中，Taq DNA聚合酶对每个引物进行延伸。DNA聚合酶具有外切核酸酶活性，因此在延伸过程中会切除下游的探针。一旦探针被降解，报告染料就会与淬灭分子相分离。

1 、报告染料R发射的能量被淬灭分子Q所吸收和淬灭。

2 、聚合酶的外切核酸酶活性通过水解方式将报告染料与淬灭分子相分离导致了荧光信号的增加。

在每个扩增循环由于切开了探针因此实时设备探测到报告染料的增加。由于报告染料被切开，因此不能进行溶解曲线分析。双标记探针比内嵌染料有更高的特异性，这里有2个原因。首先，双标记探针具有序列特异性，只结合到互补区。第二个原因是双标记探针对每扩增的一个拷贝只释放一个分子的荧光染料。由于双标记探针增加了特异性，这种探测方法很适合检测低拷贝数的模板。

2.3 FRET探针

FRET探针依靠荧光能量从一个荧光染料到另一个的传递。两个独立的特异寡核
苷酸序列都标记上荧光基团。上游探针在3‘末端有一个供体基团，下游探针在5‘末
端有一受体基团。设计探针时他们在与目标序列结合时互相临近，使供体和受体荧光
基团紧密接近。一旦探针杂交到模板上，从供体到受体荧光基团的能量传递产生了一
个不同波长的荧光信号。供体荧光信号的减弱和受体荧光信号的加强都能分别监测
到。因此，只有当两个探针都结合上去才能检测到荧光信号。FRET 探针可以进行溶
解曲线分析，对基因型分析，SNP检测和其他突变检测非常有用。

1 、扩增循环中，两个探针与靶DNA退火

2  、供体被外部光源激发通过能量传递导致发射荧光的产生。

2.4 分子信标

第四种检测方法是分子信标（MB）。这种探针的基本特征是有一个发夹结构，在此结构的一个末端有一个荧光染料报告基团，在另一个末端有一个淬灭分子。

这个发夹结构能使MB探针在不杂交时保持折叠状态，报告基团和淬灭分子处于极端接近的距离，几乎没有荧光信号发出。然而，当MB与模板杂交时，发夹结构被破坏，发色团不会被淬灭。在这个时间点，实时仪器能探测到荧光信号。用MB探针也可以进行溶解曲线分析。

1 、分子信标的发夹结构淬灭了荧光信号

2 、杂交后开始发射荧光信号

得益于实时探测技术的实际应用数量和应用类型影响深远。其中的一些益处包括有机体的鉴定，诊断性检测，基因表达研究，突变检测，SNP检测，基因型和微阵列结果确证等。每种不同的化学物质根据应用的不同会提供给用户不同的便利。应该注意的是，得益于实时探测技术并建立在荧光化学物质基础上的还有其他检测核酸的等温扩增系统。

2.6 AmplifluorTM直直接基因系统

AmplifluorTM直直接基因系统基本特征是激发的荧光进行分子能量转移到受体成分导致荧光发射的淬灭。目标特异性AmplifluorTM直引物包含一个5‘内部互补序列，标记有荧光发色团（fluorescerin）和一个能量受体：4-（二甲胺）氮-苯磺酸（DABSYL）。发夹结构的3‘端序列是目标特异性引物区。未结合的AmplifluorTM直引物由于内部荧光发色团和淬灭分子的紧密接近，只有低的荧光信号。进一步的信息可查阅网站www.intergenco.com。

在第一个循环中，Amplifluor引物1与特异CDNA的第一条链退火并被Taq酶延伸。在第二个循环中 Amplifluor引物1延伸产物作为引物2（反义链引物）的模板。一旦引物2被Taq酶延伸，Amplifluor发夹引物解折叠并产生荧光信号。随后的扩增循环中产生的荧光信号的增强与扩增产物量的增加成比例。

3、 SG, 双标记探针和FRET探针的优化

3.1 SYBR-GREEN I (SG)

为优化SG反应，有必要在所有的常规步骤来确定，优化扩增反应的条件（合适的MgCl2,dNTP和Taq酶浓度等）。结果应该在凝胶电泳上有唯一的条带。

SG分析的优化主要包括以下4个因素：

1、 SG 浓度

2 、引物浓度

3、 MgCl₂浓度

4、 温度和反应次数

1、 SG浓度

为获得合适的SG浓度应该做一下不同稀释度的实验。就像上文描述的那样（章节2.1），SG的原则是嵌入dsDNA中，因此SG直接关系到扩增反应的情况。过高的SG浓度会抑制反应。相反，SG浓度不够会导致没有足够的SG来标记扩增子。合适的SG浓度应该有一个折衷的考虑。

推荐的SG终浓度变动范围是1：5000到1：100000。经常用到的浓度范围是1：10000到1：70000。

SG优化分析

SG浓度范围是1;30000到1：400000。原始数据（a）展示了前四个稀释度（1：30000，1：40000，1：50000，1：60000）出现最大的荧光信号增强，而下一级的稀释度（1：125000，1：250000，1：300000，1：400000）出现较低的荧光信号增强。溶解曲线数据（b）得出相同的结果。在图（c）中定量数据显示最低的Ct值属于样本1：40000，1：50000和1：60000。选取1：50000做进一步的实验。

优化分析的目的是找到最适SG浓度，确保没有引物二聚体产生，同时获得最强的荧光信号增加和最低的Ct值。

2、 引物浓度

引物浓度的优化应该测试不同浓度的正向和反向引物。引物浓度的范围应该是50nM到300nM，然而，也有例外的情况。应该在固定DNA模板量的情况下作一系列的稀释度，同时也要在没有模板的对照组（NTC）作相同的稀释度。针对于具有DNA模板的给定反应的最适引物浓度应该得到低Ct值和荧光信号的高增长（5到50倍），同时没有DNA模板（NTC）的对照体系具有低Ct值。发生在NTC中的扩增是由于形成引物二聚体和非特异扩增产物。

同时也应该做这两种反应的溶解曲线。对于有DNA模板的反应应该得到单一的峰，在较低的溶解温度也没有其他峰出现。在较低的溶解温度出现其他峰可能是反应中引物浓度过高。引物的量应该适当减少。

推荐用HPLC纯化后的引物。虽然对扩增产物没有太大差别，但对于NTC可能有较大的差别。用未纯化的引物得到的扩增曲线可能导致Ct值的较大差异。纯化后的引物相比于未纯化引物有更好的敏感性。这对于SG反应尤其重要，因为非特异产物导致阳性对照品中的SG信号。另一方面也有报道说纯化引物和未纯化引物没有差别，可能与个别反应有关。

MgCl₂ 浓度

如上所述，SG反应能探测所有双链DNA。与可以容忍非特异扩增产物和引物二聚体的双标记探针相比，能扩增出特异产物对于SG反应非常重要。这可以通过降低反应体系中的MgCl2用量来获得。

获得最适MgCl2浓度的理想方法是做一系列的稀释度。检测到MgCl2的最低终浓度是1.5mM。做各种稀释度时应该包括NTC。4 模板和反应次数

    另一种优化反应的方法是选择扩增的最适温度。三个温度很重要：变性，退火和延伸温度。对于变性温度我们推荐95度，延伸温度推荐用72度，根据所用酶的不同这个温度可以变动，请参考生产者的推荐书。然而退火温度对反应有动态的影响，为了找到最适退货温度首先咨询生产引物的公司。除非例外，还需要额外的优化，这通过检测不同的退货温度来获得。一般而言，温度越高，反应特异性越好。

扩增反应所用的时间也很重要。最适于SG的延伸时间很难预测。基因组DNA相比于质粒DNA需要较长的变形时间，较短的扩增子相比较长的扩增子较短的延伸时间已经足够。对于扩增子长度为200-300bp的给定CDNA扩增反应我们推荐以下的程序，

此程序只是一般的推荐，退火温度还需要调整。关于优化扩增反应在f部分有进一步的建议。

5 、使引物二聚体消失

这一部分描述了即使出现引物二聚体，如何在Roter-Gene上获得好的数据。虽然以上描述的优化步骤都应该履行，Roter-Gene上的软件的一个功能可以让我们在原始数据屏幕和定量屏幕上看到减少的引物二聚体数量。一旦感兴趣基因和引物二聚体的溶解温度确定下来，可以引入第四步—temperature profile（温度描绘）中的一个功能。通过按压edit profile中的“+”，在profile中简单加一个额外的温度步骤，在引物二聚体溶解温度以上，扩增子溶解温度以下的温度点获得数据。这个额外步骤应维持15秒。由于温度比较高，增加非特异产物不太可能。由于在2个温度都获得数据，有可能确定结果之间的差别。

从2个不同温度获得数据的SG反应

循环A和循环B分别在72度和84度获得数据。红色，桔红色和棕色曲线分别代表6种不同的DNA浓度，蓝色样品代表合适的NTCs。在循环A中看不到NTC，循环B中看不到非特异扩增产物。溶解曲线显示DNA产物在右侧，NTCs在左侧。

6 、SG反应中的小窍门和经常会问到的问题

1 、尽管有以上的优化步骤，有时候反应还不能正常进行。这主要源于DNA的纯度，可能是PCR抑制物使扩增反应不能进行。一个检测反应抑制物的可能办法是将反应混合物与已知模板和适当引物混合，如果不能反应则可能是抑制剂的原因。

2 、如果SG反应不能正常进行，有报道说0.025%Tween-20对SG反应有利。

通常SG稀释在水或TE缓冲液中。将SG稀释在DMSO中有可能解决一些研究者在贮存稀释后的SG时遇到的问题。

3 、关于制备个人用1undefinedSG Master

混合：

100mM Tris pH 8.3

500mM KCl

0.1% Tween-20

8%Glycerol

1undefinedSG (依赖优化的结果)

4 、下列的Master Mix由Morrison et al.报道，

Biotechniques(1998)24(6):954

50mM Tris pH 8.3

3mM MgCl₂

0.5 mg/ml BSA

0.2mM each dNTP

0.3undefinedSG(从分子探针)（或者你的优化浓度）

50Units/ml HotStarTaq-polymerase(Qiagen)

50nM 到 300nM/每个引物

总共20微升的反应体系含一微升模板

5 、为了在SG反应后作溶解曲线，引入与溶解曲线起始温度点相同的保温步骤（大约
60秒），这样可以确保溶解温度起始于一个确定的温度。

6 、溶解曲线分析可以重复。可以在相当一段时间内重新作溶解曲线，甚至到第二天也
可以。

7 、关于可以用SG检测的引物对的列表，请查询www.realtimeprimers.org。

进行SG分析的典型程序是什么？

变性：检查反应所用的酶（2min,5min,10min或15min）

循环：95度/20秒，退火温度/20秒，72度/20秒

保温：72度/60秒

溶解：72-99度，on Melt A

要获得更多的细节请参考3.1.4

8、 在哪个通道SG可以被检测？

发射:：470nm

检测：510nm(双通道机型/多通道机型)

发射：470nm

检测：585nm (多通道机型)

9 、SG的稳定性如何？

只要不进行稀释，SG是非常稳定的。一旦稀释，可以保存1周到3个月，这取决于冻融次数，推荐配置成一定浓度的贮存液，用时现用现配稀释液。

10、 随着mRNA和随后得到的cDNA和DNA的数量和质量的提高，检测到低拷贝数的能力会增强。用到的引物浓度通常是50nM到300nM。

11、 利用SG作溶解曲线分析的结果会因以下的因素而有所差别：a)产物的大小 b)产物的GC含量。由于以上的因素单核苷酸多态性（SNP）有可能检测不到。

12 、推荐用HPLC纯化引物。虽然对于复制子的扩增没有太大影响，对NTC可能会有很大影响。

13、 尽管更长的扩增子也能进行反应，最适的扩增子长度应该是100-200bp。

14、由于很多因素的影响扩增子的溶解温度会有一定变异。溶解温度会受特殊缓冲液的pH值，所用Taq聚合酶，SG和MgCl2浓度和其他因素的影响。要做溶解曲线的对比你首先要确保所用的条件相同。

15 、使用SG的一个主要不利因素是引物二聚体的非特异扩增。我们最近利用Qiagen的QuantiTectTM SYBRR Green PCR试剂盒得出相当好的结果。重复试验的结果非常接近，NTC根本没有出现扩增。这个试剂盒对于利用SG扩增低拷贝数的模板非常有用。