小鼠中的基因修饰――2007年度诺贝尔生理或医学奖介绍

1 关于基因改造的研究

1.1 胚胎干细胞

干细胞都可以进行多次分裂增殖（自生），并产生多种分化程度更高的子细胞。成体干细胞在各种成体组织的自生和修复中都发挥着不可替代的作用，比如骨髓中的造血干细胞可以通过分化产生各种血细胞，包括红细胞、巨核细胞、血小板以及多种淋巴细胞。

成体组织的干细胞只能分化成某一系列的特定细胞，而早期的胚胎干细胞却具有全能性，也就是说，它们可以分化产生生物体中所有类型的细胞。因此，也许能使用囊胚时期的胚胎干细胞产生一个活体哺乳动物的想法让科学家们为之兴奋并努力了许多年。

已分化的细胞和组织来自于未分化的干细胞，这一概念的提出已经有100 年的时间了[1]。但是，经过科学家们几十年的研究，其具体的机制仍没有明确的答案。

有关睾丸畸形瘤的研究显示，在这些肿瘤组织中含有全能干细胞。20 世纪50 年代， Jackson 实验室的Leroy Stevens 发现，129Sv 品系的小鼠具有这种肿瘤高发的表现型。他发现这些细胞可以长成胚状体，也就是一群胚胎-细胞的聚合体。

将这些肿瘤细胞移植时，它们所形成的聚合体可以导致实体肿瘤的产生，这些肿瘤中包括许多种细胞类型[2,3]。几年之后，Kleinsmith 和Pierce 证实了这类肿瘤来自于未分化的胚性癌细胞[4]。细胞培养技术的发展，使得众多的研究者都可以从小鼠睾丸畸形瘤建立起体外培养的癌细胞系。70 年代前后，包括剑桥大学的Martin Evans 在内的许多科学家都报道了这种培养方法[5~7]。

在这种情况下，Evans 感到必须采用另一种替代方式，由胚胎干细胞产生具有一定遗传特点的生殖细胞系。通过使用单克隆抗体，他鉴定了胚胎干细胞表面的大分子以及它们的配体，从而确定了一系列分化早期的分子标志[13]。

这些结果显示，可能存在与胚胎干细胞类似表型的细胞，并且可用于实验。1980 年，Evans 与胚胎学家Matt Kaufman 合作，试图将体外细胞培养与胚胎细胞技术结合起来。Evans在之后的一篇综述中写道，他想要进行单倍体胚胎细胞的培养，但是准备先用二倍体细胞作为对照。

原文如下[14]：“我向培养的组织中移植了这些胚泡，并使用了最高效的培养基―――已证明它对于小鼠和人胚胎干细胞而言能获得最高的增殖效率―――此后很快我就注意到，大量胚胎干细胞样的细胞产生了。

多项鉴定结果都显示这些细胞的确是我们想要的多能干细胞：它们在体内可形成畸胎瘤，在体外培养则可发生分化；它们具有我们预期出现的干细胞表面抗原；碱性磷酸酶染色显示这些细胞呈强阳性，并且具有正常的核型，最重要的是，它们可以形成极好的嵌合体。”

Evans等建立了胚泡注射技术，以便检验胚胎干细胞能否产生具有正常功能的生殖细胞，并用于产生嵌合体小鼠。1984 年，他们成功地造出了具有正常遗传功能的生殖细胞，这篇里程碑式的文章发表于另一期《自然》杂志[17]。

在已有实验的基础上，下一步的操作就是检验是否可以向胚胎干细胞中导入遗传物质，并进一步传递到生殖细胞中。Evans和他的同事们使用一种重组的逆转录病毒来感染胚胎干细胞，然后再把这些细胞注入胚泡[18]。

经过以上步骤，逆转录病毒的 DNA可以在第一批嵌合体小鼠以及F1代小鼠中检测到，这表明外源DNA 已成功导入小鼠的生殖细胞[19]。

1986 年10 月，Evans 等人在《自然》杂志上发表了他们的发现，并总结道：“体外培养胚胎干细胞的实验，为产生转基因动物提供了一种有效的途径”[19]。同年12 月，另外一个实验室宣布已通过使用逆转录病毒感染胚胎干细胞的方法，得到了含有新霉素抗性的生殖细胞[20]。

2 基因靶向以及哺乳动物的转基因操作

2.1 转基因小鼠

几十年来，小鼠一直是遗传学研究中最常用的实验动物，因而也成为尝试将新基因导入哺乳动物基因组的首选。有多个实验室探索出了对小鼠卵细胞和胚泡进行体外实验操作的最佳条件。在这个基础上，将SV40 病毒的DNA 导入胚泡中，之后将这些胚泡移植到代孕母鼠体内。

在这种小鼠的后代中可以检测到SV40 病毒的DNA，但是无法确证这些DNA 已经整合到宿主小鼠的基因组中[25]。几年之后，通过使用莫洛尼氏白血病毒感染胚胎干细胞，诞生了第一只转基因小鼠[26]。

在这只转基因小鼠的基因组中检测到了由病毒RNA逆转录而来的 DNA片段，并且这些片段可以遵循孟德尔遗传定律传递给后代，至此说明病毒DNA 已经成功整合入小鼠的生殖细胞系。

随后，这一技术迅速发展，使得在小鼠以及许多其他哺乳动物体内引入和过表达大量目的基因成为可能[27]。然而，转基因插入宿主基因组这一行为是随机的，拷贝数也并不一致。

因此尽管转基因技术已成为生命科学研究中的一种重要方法，它仍然缺乏一定的准确性，在进行内源基因的操作时仍然无法预测结果。转基因过表达技术这些内在的固有缺陷在某种程度上限制了它的用途。

2.2 同源重组

早在半个世纪前，Joshua Lederberg 在细菌实验中就发现了同源基因重组的基本原理，他因此获得了1958 年的诺贝尔奖。20 世纪70 年代，越来越多的证据表明，真核细胞也具有类似的机制，即在减数分裂期能够在同源染色体之间交换遗传信息。

继早期对酵母的研究之后人们又进一步证明，哺乳动物基因组中的逆转录病毒DNA 片段与外源导入的逆转录病毒DNA 之间也存在着同源重组现象。Richard Axel （因发现嗅觉受体而获得2004 年度诺贝尔生理或医学奖）的工作显示，可以通过导入疱疹病毒的胸苷激酶（tk）基因来修复体外培养的胸苷激酶缺陷的哺乳动物细胞[28]。

在这一结果的基础上，Mario Capecchi改进了实验方法，他将 DNA 通过尖细的玻璃吸管直接注入到细胞核中[29]，这样做极大地提高了基因转移的效率，因此 Capecchi的方法很快就被其他研究者用于向小鼠受精卵中导入新基因以产生转基因鼠[30]。然而，采用这种方法转移的基因仍然是随机地导入宿主的基因组。

在这种情况下，Capecchi观察到了至关重要的结果：当注入tk 基因时，基因的拷贝只被整合入基因组的1～2 个位置，而多数的拷贝则会形成许多头尾连接的串联体产物。他推断这种串联结构的产生有两种可能：即自身复制或同源重组。

基于这一想法，他进行了一系列严谨的实验，这些实验最终清楚地表明这种串联体的产生来自于同源重组[31]。这一结果，反过来又证明了哺乳动物细胞都具有同源重组的高效酶促反应机制。如果利用这套机制来诱导外源DNA 序列与宿主基因组中相同 DNA 序列间的同源重组，那么细胞中绝大多数基因都可以被人为突变。

Capecchi向美国国立卫生院提交了关于检测在哺乳动物内进行基因打靶的可行性的提案。然而这一提案被否决了。其原因是评审者认为导入的 DNA片段在宿主的基因组里找到它的匹配序列是相当困难的（Capecchi后来的综述里引用了这一观点[32]）。

与此同时，Martin Evans 等在英国向医学研究委员会提交了类似的提案，被认为野心太大，也被否决了。尽管美国国立卫生院不同意这一提案，Capecchi仍决定继续研究同源重组。他做出了没有新霉素抗性的缺陷型细胞，而这一缺陷能够通过导入新霉素抗性基因来修复[23]。

在这个实验中他得到了很高的修复频率（每一千个被注射的细胞里出现一个被修复的细胞），这使得同源重组应用于操作哺乳动物基因组成为可能。
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