荧光标记DNA探针在细胞核混悬液杂交中的应用

（1）细胞核的分离：将培养的细胞制成细胞混悬液，或以胰蛋白酶消化法于培养盖上收集培养细胞。应用MgSO4染色分离方法分离细胞核（Van den Engh et al 1986, 在Traok和Van Den Engh 34章　）。细胞混悬液浓度为5×106/ml。利用RNA酶消化后，使核从细胞分离，细胞核混悬液浓度为4～5×106细胞核/ml。

（2）细胞固定和酸的处理：在5 ml试管内加冷的100%酒精不断旋转以达到满意的固定。在冰上停留10 min。在4 ℃离心（×150 g）10 min。重复加三次冷的100%酒精入试管内，离心，倾去。置于冰上10 min，再离心。然后加入相当核悬液1/2量的0.1 n HCl , 0.5% Triton X-100。

室温停留10 min。加入IBM-0.25%Triton X-100（IBM配方：50 mmol/l KCl, 10 mmol/L MgSO4, 5 mmol/L HEPES pH8.0）。再离心，重复IBM漂洗（这时细胞核可在不染色情况下，以荧光显微镜观察）后，以2×SSC-0.1%Tween漂洗1×3min，继之加入等量2%的多聚甲醛在1×PBS-5 mmol/l MgSO4。在室温静置站立10 min。

倾去上清液，加IBm -Triton X-100漂洗，离心，使细胞核混悬液最终浓度为108/ml，（可用IBM-Triton X-100稀释约50倍，在血球计数器计数），混悬液镜检应含单个，完整的细胞核。

⑤和组织切片与DNA探针杂交方法相较，不同的是在加热变性后切勿置冰上迅速冷却以终止反应，而应迅速转入37 ℃孵育过夜。

注：DEMS处理红细胞方法：经漂洗并离心去除白细胞和血清的红细胞在盐液如PBS中，细胞含量为108/ml，以K2CO3和DEMS溶液处理3次，第1次：K2CO3为20 mmol/L,DEMS为3 mmol/L，以后2次：K2CO3依然为20 mmol/L，而DEMS为10 mmol/L。

在应用前将K2CO3和DEMS液混合加入红细胞混悬液中。在最后2次漂洗液中，应用100 mmol/l K2CO3将pH调至9～10。在25 ℃，15 min后，加入50 μl，100 mmol/l 的柠檬酸（citric acid）/每ml细胞混悬液的浓度以达固定红细胞的目的。

固定的红细胞离心倾去上清液后，用2×SSC稀释到108/ml，加0.1%叠氮钠可在4 ℃保存至少1年。

（5）AFF标记的荧光显示：加200 μl的PBS含0.05%Tween和2%正常血清（NGS），轻轻振荡混匀，室温静置10 min，加20 μl 1：100的单克隆抗AFF抗体，37 ℃孵育45 min，加1.25 ml的PBS-Tween，室温静置10 min，加20间歇性振荡，离心，倾去上清液，加200 μl PBS含0.05%Tween –2%NGS,振荡，室温静置10min，加20 μl的羊抗小鼠–FITC荧光标记抗血清，稀释度1：100～1：300。

孵育于37 ℃ 45 min，加1.25 ml PBS –Tween,室温静置10 min，离心，倾去上清液。

（6）生物素标记探针的荧光显示：加200 μl 4×SSC含0.1%Trion X-100 和5%BSA。室温静置10 min后，加20 μl抗生物素标记FITC抗血清15 μg/ml，孵育在37 ℃ 30 min，以1.5 ml 4×SSc –0.1% Trion X-100洗1次，加入1.25 ml IBm –Triton X-100,室温静置10～15 min，间歇振荡、离心。

（7）荧光显微镜观察：将细胞核混悬液稀释于250 μl的IBM-Trion X-100中，轻加振荡混匀。为抗荧光褪色可加等量的抗褪色溶液至载片上的细胞核涂片上，选择适当的激发波长观察。