荧光标记的染色体原位杂交及其在人类基因组研究中的应用

【摘 要 】FISH技术是80年代开始发展起来的一种新的定位技术。在人类基因组研究中得到了广泛的应用。通过中期染色体的FISH可以进行SCP，Cosmid和YAC的染色体定位，嵌合克隆的鉴别；通过间期核的FISH可以在50kb的分辨率下进行基因作图；最新的研究进展已可以进行伸展的染色质丝（chromatin fibre）的FISH，直接测量基因的长度，从而达到高精度基因作图的目的，总之，随着FISH技术本身的发展，它将在人类基因组研究中发挥更大的作用。

【关键词 】FISH，人类基因组研究，染色体定位，基因作图。

荧光标记的染色体原位杂交技术提供了一种快速而有效的手段，将DNA片断和特定的真核生物细胞的染色体区带联系了起来，并将这些DNA片断排序，这是研究DNA顺序在染色体上位置的最直接的方法。

最早，人们根据Gall和Pardue在1969年的工作，于70年代，建立起了同位素原位杂交技术，但当时只是用于DNA顺序在多线染色体上的定位或是重复顺序在中期染色体上的定位。

1981年，Gerhard和Harper等首先证明有可能将从个体基因中得到的单拷贝顺序（SCP，single copy probe）通过同位素原位杂交技术定位到中期染色体上。在此基础上，80年代初起，荧光标记的原位杂交技术开始起步并得到运用且不断地发展。

1.SFIH技术简介

FISH技术包括下列几个步骤：a.探针的准备和标记；b.探针和染色体的杂交；c.信号检测；d.杂

1.1生物素，地谷新（digoxigenin），二硝基苯（dinitrophenyl，DNP），氨基乙酰芴（aminoacetylfuorene，AAF），汞和磺酸盐（sulfonate）。

就掺入方式来说，生物素，地谷新等是以核苷酸衍生物的形式掺入的，可用切口平移法来进行的，现在更多的人开始用随机引物法，用这两种方法标记好的探针大小在200－500bp范围内，是用于杂交的最佳大小。另外，也可以在已知顺序的两个引物之间用PCR法来扩增，或从合适的载体上通过RNA转录而来。

1.2探针和染色体的杂交

最佳杂交条件取决于探针和目标的性质。已标记好的变性的探针（200－500bp）与变性的染色体在含有甲酸胺，盐和硫酸葡萄聚糖的杂交缓冲液中杂交过夜接着是柔和的洗涤，以去除未杂交或错配对的探针。

1.3信号的检测

在洗去未杂交和错配对的探针分子之后，载片培养在免疫荧光试剂中，使其在探针杂交的位置上产生荧光信号，偶联了荧光素分子的抗生物素蛋白被用来标记已掺入到探针分子中的生物素。地谷新，二硝基苯，AFF和硫磺酸盐则可以用相应地标上了荧光素地抗免疫球蛋白来标记。

最常用地荧光素分子有FITC，rrhodamine和Texas Red等。

1.4分带和信号定位

染色体地分带可以在杂交前，也可以在杂交后。高分辨的染色体标本是取得最好的带形的基础。

常用的分带方法有G（giemsa）带、Q（quinacrine）带、R（reverse）带，包括色霉素chromomycin A3/偏端霉素distamycin A法；hoechst33258/propidium iodide[3，8-二氨基-5-[3-（二乙基-甲基氨）丙基]6－苯菲碘]法；DAPI[DAPI：4，6-diamidino-2-phenylindole 2HCl]/propidium lodide法，染色体的分带也可以直接用Alu LIHs(LI homo sapiens)或Alu之间的顺序和染色体杂交而得到类似R带的条带。

更多的人在努力使杂交信号和分带可以同时在显微镜下看到。

由于杂交和分带同时进行效果不佳，有人采用FL（fractional length）来测量。以杂交信号相对于某固定位置（如端粒）的长度占该染色体长度的比例来表示。

在不分带的情况下，特定的染色体可以通过着丝粒特异，或端粒特异的探针进行共杂交来确定。复杂的探针族，如从一个染色体特异的DNA文库中得来克隆，可以用来修饰和确认染色体，称为染色体绘图。

影响杂交结果的参数有下列几个：探针浓度，杂交时间，探针大小，杂交温度，染色质变性条件染色体得制备和硬化程度，Rnase作用条件，用于降低背景的非特异性竞争DNA和醋酸酐处理，具体地讲是DNA探针的纯度；用于杂交反应的探针的大小，小心掌握好这些条件，我们就能得到没有荧光背景的特异信号。

FISH的结果还有一个重要的方面，就是分辨率的问题。影响结果分辨率的因素有两个，染色体上的特异位置和染色体的浓缩程度。着丝粒和端粒的变化比其他的染色体位置的变化要多，在分析结果时就比较容易辨认。

特定的染色体结构在其杂交结果的分辨率上起着重要的作用。制备染色体比较伸展状态的展片，如早中期染色体或中期染色体，将会得到较高的分辨率。另外，光学系统的进步也是提高分辨率的有效手段。

2.FISH技术的有点

FISH技术和同位素原位杂交相比，有着许多的优点。

首先，从探针的制备杂交来看，生物素和其他标记分子没有放射性，标记过程和杂交过程没有污染的危险，比较安全。且用生物素或其他的标记分子标记好以后的探针分子相当稳定，没有半衰期的限制，可以长期保存。

荧光显色时间短，不像同位素杂交要求长时间曝光。背景简单，灵敏度也不逊色。另外，FISH可以用多种颜色同时显色。这是同位素杂交不可比拟的。这种多色作图，可以使染色体分带和探针信号不同的颜色而同时观察；也可以用不同荧光标记不同的探针，以确定探针在染色体上的相对位置。

间期核作图也是FISH的一个特色，因为它常常核多色技术结合在一起。中期染色体的FISH的分辨率大约为1Mb，而间期核作图的精度为50kb。这一精度的变化使FISH有可能直接用于基因作图。可以朔间期核作图技术是遗传研究和脉冲电泳结果的桥梁。

与遗传图谱不同，它不依靠多态性指标和大的家系；也不像脉冲电泳后的稀切点酶物理图谱分析，它不依靠稀切点的存在和甲基化程度，并且不受CpG岛出现频率的影响。它的原理是间期核上DNA顺序间的距离与线性DNA分子上该两个顺序间的距离呈对应的线性关系。

由于这些原因间期核作图可以作为遗传作图核物理作图分析的辅助结果构建染色体亚区的基因图。间期细胞原位杂交还可用于不能制备中期染色体的细胞的研究，如肿瘤细胞核非周期细胞。

信号扩增也是FISH所特有的。为了使杂交信号足够强，可以进行信号扩增。扩增的方法是加上一层荧光标记的标记分子的抗体，再加上一层偶联了标记分子的抗体，然后再加上一层荧光标记的标记分子的抗体，形成三明治结构。

以生物素标记为例，在加荧光标记的抗体生物素蛋白avidin之后，加一层山羊生物素标记抗-抗生物素D，然后再加上一层荧光标记的抗生物素蛋白。