TIL （肿瘤浸润淋巴细胞）细胞的培养

肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte,TIL）是从手术切除的肿瘤组织或转移的淋巴结中分离的淋巴细胞，经细胞因子（如IL－2）诱导活化，经大量增殖后回输给原病人。

TIL 细胞是一种较LAK 细胞杀瘤效果好、特异性高，而扩增时对IL－2 的作用浓度要求更低的肿瘤杀伤细胞。

试剂和材料

● 手术切除的肿瘤组织

● 淋巴细胞分离液（100％及用1640 配制75％浓度）

● 培养液：RPMI1640 培养液＋10％AB 型血清＋IL－2（200u/ml）或X－VIVO15 培养液

● 消化液：IV 型胶原酶（230u/g）、I 型DNA 酶3600u 、V 型透明质酸酶（1500u/g）

● 器皿与仪器：75cm2 培养瓶，15ml 聚丙烯试管，手术刀、剪、镊，CO 2 孵箱，三角烧瓶，磁力搅拌器等

实验操作

1.在无菌条件下将切除新鲜瘤体组织去除坏死部分与结缔组织，用RPMI1640 培养液冲洗干净，移至无菌平皿内用手术剪将肿瘤组织剪碎至1－2mm3 小块，置于3600u DNA 酶、50μg 胶原酶和125u 透明质酸酶的RPMI1640 培养液40ml 中，混匀并移至带有磁棒的无菌三角烧瓶内，于37℃恒温的磁力搅拌器上搅拌1－2 小时。

2.用200 目孔径的不锈钢滤网将酶消化后的细胞悬液过滤，以除去未消化好的肿瘤组织块。经1500r/min 收集单个细胞，用RPMI1640 或X－VIVO15 培养液洗细胞2 次，将细胞再悬浮。

3.梯度离心分离TIL 细胞：于无菌离心管内分层放入100％及75％的淋巴细胞分离液，其上再沿管壁轻轻加入细胞悬液，经2000r/min 离心20min，收集100％分离液界面上的细胞为富含TIL 细胞的悬液（75％的界面上是肿瘤细胞），再用RPMI1640 或X－VIVO15 培养液将TIL 细胞洗2 次，以除去细胞分离液。

4.将洗过2 次的TIL 细胞用含10％AB 型血清、20％LAK 细胞培养上清液及200u/ml IL－2 的RPMI1640 培养液再悬浮。（或用20％LAK 细胞培养 上清液及200u/ml IL－2 的X－VIVO15 培养液代替RPMI1640 培养液），细胞浓度调至3－5×10 5 ／ml,分装于75cm2 培养瓶 中，置5％CO 2 孵箱中37℃培养。

约每周换液1－2 次，培养15－20 天左右可回输给原病人。TIL 细胞最多可培养3 个月。

质控与提示

1.TIL 细胞在低浓度（50u/ml）或高浓度（1000u/ml）的IL－2 作用下才能扩增，而LAK细胞只能在高浓度（1000u/ml）IL－2 下才能扩增。

2.来源于黑色素瘤及肾细胞癌组织中的TIL 细胞，扩增培养的成功率在70％。扩增失败的原因常由于肿瘤标本的大部分已坏死或浸润淋巴细胞数量太少之故。

3.若加入饲养层细胞（feeder cell）,如用EB 病毒感染的同种异体B 淋巴细胞（B－EBV）作为饲养细胞，可加快TIL 的扩增速度，但此技术仅限于研究用。为增强TIL 杀伤自身肿瘤细胞的活性，有些研究人员在培养TIL 细胞的环境中加入自体肿瘤细胞。