Nature子刊：英国科学家利用CRISPR技术构建出一个小鼠全基因组gRNAs文库

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英国威康信托基金会桑格研究所的研究人员利用CRISPR技术设计出多种新的导向RNAs，由此构建出一个可靶向小鼠基因组中每个基因的导向RNAs文库。这一研究有助于研究不同细胞类型中每个基因的作用。相关文章发表于2013年12月23日的《Nature Biotechnology》杂志上。

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<center> Nature子刊：英国科学家利用CRISPR技术构建出一个小鼠全基因组 gRNAs文库</center>

CRISPR技术介绍

CRISPR技术是指利用一段与靶序列相同的导向RNA来引导Cas9核酸酶 对特异性靶向DNA进行识别和切割，造成DNA的双链或单链断裂。

然后，细胞会利用自身具备的两种DNA复制机制：即非同源性末端结合(Non-homologous end joining, NHEJ)或同源介导的修复(Homology-directed repair, HDR)对断裂的DNA进行修复。这一技术简单高效，科学家们可以采用标准的分子生物学 技术，轻易地设计出多种新的导向RNAs。

小鼠基因组CRISPR导向rna s文库的构建

研究小组发现在测试52个导向RNAs中，有50个可成功切割基因的两个拷贝。这些遗传 工程改造的导向RNAs在许多的细胞类型中似乎都取得了一致的极高成功率，由此引导他们构建出了一个可靶向小鼠基因组中每个基因的导向RNAs文库。

威康信托基金会桑格研究所的Kosuke Yusa博士说：“CRISPR技术正在彻底变革我们研究细胞 行为的方式。我们已经开发出了一个全面的文库，其他的研究人员可利用它不同细胞类型中每个基因的作用。我们可以为所有的细胞或物种构建出这种类型的文库。”

研究人员设计出了一个包含近90,000条这样的导向RNAs的文库，可以利用这些导向RNAs来靶向和改变小鼠基因组中所有的基因，并构建出了一些小鼠突变胚胎干细胞。他们利用小鼠突变干细胞针对一种细菌毒素：腐败梭菌α毒素进行了一次遗传筛查，更好地了解了对这一毒素产生抗性的机制：这种毒素对于所有的细胞类型都具有毒性效应。

gRNAs文库的应用

研究小组靶向了26个已知与这种细菌毒素受体合成相关的基因。他们揭示出其中17个基因导致了抗性发生。重要的是，他们还发现了从前未知的一些基因，它们发生突变赋予了对这种有毒物质的抗性。

研究小组现在将利用这一导向RNAs文库在癌细胞系中构建突变。细胞可快速地产生耐药并抵抗治疗是癌症药物治疗中的一个主要问题。通过筛查突变导致，研究小组可以确定哪些基因与癌症治疗耐药有关，由此寻找到临床靶点。

原文摘要：

Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library

Hiroko Koike-Yusa, Yilong Li, E-Pien Tan, Martin Del Castillo Velasco-Herrera & Kosuke Yusa

Identification of genes influencing a phenotype of interest is frequently achieved through genetic screening by RNA interference (RNAi) or knockouts. However, RNAi may only achieve partial depletion of gene activity, and knockout-based screens are difficult in diploid mammalian cells. Here we took advantage of the efficiency and high throughput of genome editing based on type II, clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats (CRISPR)–CRISPR-associated (Cas) systems to introduce genome-wide targeted mutations in mouse embryonic stem cells (ESCs). We designed 87,897 guide RNAs (gRNAs) targeting 19,150 mouse protein-coding genes and used a lentiviral vector to express these gRNAs in ESCs that constitutively express Cas9. Screening the resulting ESC mutant libraries for resistance to either Clostridium septicum alpha-toxin or 6-thioguanine identified 27 known and 4 previously unknown genes implicated in these phenotypes. Our results demonstrate the potential for efficient loss-of-function screening using the CRISPR-Cas9 system.