菊苣组织培养及无性系建立

一、材料和方法

1. 材料及灭菌

将田间生长旺盛、具有有利变异性状的菊苣采回来后，切去叶片。将叶柄放到磨口瓶中，用自来水冲洗4次后，用0.05%安利洗涤液洗涤30min，洗至无泡沫时置于超净工作台上。

用75%乙醇灭菌20s后迅速用无菌水洗涤3次，接着用0.1%HgCl2溶液振荡灭菌1min，再用0.05%HgCl2溶液振荡灭菌12min，接着用无菌水振荡洗涤6次。即获得无菌材料。

2. 培养条件

培养基以MS、I/2 MS和1/3 MS为基本培养基，附加不同浓度的细胞分裂素BA和生长素IAA、NAA、2，4-D丁酯。以MS为基本培养基时，加蔗糖30g/L；以l/2 MS为基本培养基时，加蔗糖15g/L；以1/3 MS为基本培养基时，加蔗糖10g/L。培养基胨力强度为180g/cm2，pH值5.8~6.0。培养温度18~26℃，光照l0~12h/d。光照强度2000~3000lx。

3. 试验方法

（1）愈伤组织诱导培养 将无菌叶柄切成0.2cm左右的块接种到以MS为基本培养基，附加不同浓度的BA、NAA、IAA和2，4-D丁酯的培养基上，进行愈伤组织的诱导，60d后观察统计。

（2）愈伤组织及不定芽的分化培养 将在诱导菊苣叶柄形成愈伤组织的理想培养基上诱导出的叶柄颗粒状愈伤组织接种到附加不同浓度BA、NAA的l/2 MS+AgN03 20.5mg/L和l/3 MS+AgN03 20.5mg/L培养基上，进行愈伤组织的分化培养。

（3）不定芽生根培养 将上述分化培养的不定芽从基部剪下，接种到以1/2 MS和1/3 MS为基本培养基，附加不同浓度IAA、NAA和IBA的生根培养基上进行生根培养。培养到l0d时有的培养基上可见形成根原基。培养30d时观察统计。

（4）试管苗移栽 将生根苗培养瓶瓶塞打开，置于光照约5000Lx、温度20℃左右的条件下炼苗4d后，用镊子取出。洗去基部培养基，移栽到上面铺着5～6cm厚不同基质的温室苗床上。20d后观察统计。

二、结果与分析

1. 愈伤组织的诱导

在不用激素或BA与IAA配合使用条件下，不能诱导叶柄块形成愈伤组织；而浓度分别为0.4mg/L、0.8mg/L、1.2mg/L、1.6mg/L、2.0mg/L的BA与浓度为0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L和2.5mg/L的NAA、2,4-D丁酯配合使用时，几乎所有的叶柄块都能够诱导形成愈伤组织。

但诱导的愈伤组织生长速度及外部形态却差异较大。在BA浓度为0.4mg/L、2.4-D丁酯浓度为1.6mg/L的培养基上，不仅愈伤组织的诱导率为98%，愈伤组织的生长速度快，而且所诱导的愈伤组织外观呈淡绿色的颗粒状，愈伤组织颗粒问连接松散、质地疏松。一般认为，这种愈伤组织为具有分化能力的愈伤组织。

除MS+BA 0.4mg/L+2，4-D丁酯1.6mg/L这一培养基外，在其它培养基上诱导的愈伤组织从形态、结构、颜色和质地等性状上看.均为没有分化能力的愈伤组织或分化能力差的愈伤组织。

把在MS+BA 0.4mg/L+2,4-D丁酯1.6mg/L培养基上诱导的浅绿色颗粒状愈伤组织.在同一培养基上连续继代培养9代，形成的愈伤组织仍为具有分化能力的愈伤组织。这说明MS+BA0.4mg/L+2,4-D丁酯1.6mg/L是诱导菊苣叶柄形成具有分化能力愈伤组织的理想培养基。

2. 愈伤组织与不定芽的分化培养

培养结果表明：培养10d左右，有的愈伤组织颗粒形成了绿色的芽点；培养到40d时进行统计，只有部分培养基能诱导颗粒状愈伤组织分化。其中在l/2Ms+AgN03 20.5mg/L+BA 0.3mg/L+NAA 0.1mg/L培养基上不仅分化率达98.0%。

而且分化的不定芽为高1cm左右、长势较旺盛的丛生状。把分化形成的丛生芽从基部切下.接种到相同堵养基上进行分化不定芽分化继代培养45d后1个不定芽又会分化形成一丛生长较为旺盛的丛生不定芽。40d时平均分化增殖率为7.2倍。

经过连续11次的继代培养，其分化率和长势基本保持不变。由此说明，该研究中菊苣叶柄愈伤组织和不定芽分化的理想培养基为l/2Ms+AgN03 20.5mg/L+BA 0.3mg/L+NAA 0.1mg/L。

3. 生根培养

在附加NAA和IBA的生根培养基中，难以诱导生根；在IAA浓度达到和超过0.8mg/L时，也难以诱导生根；而在IAA浓度为0.2~0.4mg/L的生根培养基上，不仅生根率达90%以上，而且单株生根数也达到5.2条以上。并且l/3 MS培养基上的生根效果好于1/2 MS。观察还表明，在上述1/3MS生根培养基上，不仅生根率高、根数多，而且试管苗长势旺盛。培养至30d时，可以长成株高为3cm左右、具有6条以上根的试管苗。表明1/3 MS+IAA 0.2~0.4mg/L是变异菊苣不定芽生根的理想培养基。

4. 移栽

以炉灰渣和河沙为移栽基质成活率较高，且长势较好。观察还表明，以炉灰渣为移栽基质时，不仅成活率最高，而且成活苗长势也最好。这说明炉灰渣是菊苣试管苗移栽的理想基质。把在温室中移栽成活试管苗移植到田间，通过3次小批量试验证明，具有优良变异性状的菊苣试管苗长势旺盛而整齐，优良的变异性状保持不变。单位面积可食嫩叶产量比实生苗提高13%~18%。

 三、讨论

迄今为止，虽然已有菊科莴苣属菊苣组织培养的报道，但未见栽培菊苣变异植株组织培养及无性系建立的报道。本研究利用变异菊苣的叶柄为外植体进行了愈伤组织诱导与分化、不定芽分化与生根、试管苗移栽与移植的研究。叶柄愈伤组织能以较高分化率分化出不定芽.证明菊苣的叶柄在离体条件下仍具有较强的生长分化力.这不仅证明栽培菊苣非分生组织细胞也具有全能性；而且还说明，通过组织培养的方法，能使大批栽培中偶尔发生的有利变异植株得到保存，为优良变异品系保存和利用提供了可能。对芽进行分化培养，40d时的分化率为7.2，按照这个增殖速度，年增殖率为7.29。这说明，通过这种方法进行快速繁殖，一年内可增殖出大量的具有有利变异性状菊苣试管苗。这为优良植株的工厂化育苗，满足生产上对优良菊苣种苗的需求提供了可能。在生根培养时，使用IAA效果较好。这是因为IAA为植物天然生长素在光照条件下分解。把待生根的不定苗接种到以IAA为生长素的生根培养基中，7d左右诱导形成根原基。此时IAA因光照大部分分解，使其含量降低到不至于抑制根的伸长生长的浓度。在移栽过程中，炉灰渣为理想的移栽基质，这是因为炉灰渣为黑色物质。具有很好吸光作用，有利于增温，为幼苗生长提供较高温度。并且炉灰渣是经高温炼烧后所得，所带杂菌少。加之其来源较广，四季皆可获得。因此，炉灰渣是变异菊苣试管苗移栽的理想基质。