菊苣组织培养及无性系建立

一、材料和方法

1. 材料及灭菌

将田间生长旺盛、具有有利变异性状的菊苣采回来后，切去叶片。将叶柄放到磨口瓶中，用自来水冲洗4次后，用0.05%安利洗涤液洗涤30min，洗至无泡沫时置于超净工作台上。

用75%乙醇灭菌20s后迅速用无菌水洗涤3次，接着用0.1%HgCl2溶液振荡灭菌1min，再用0.05%HgCl2溶液振荡灭菌12min，接着用无菌水振荡洗涤6次。即获得无菌材料。

2. 培养条件

培养基以MS、I/2 MS和1/3 MS为基本培养基，附加不同浓度的细胞分裂素BA和生长素IAA、NAA、2，4-D丁酯。以MS为基本培养基时，加蔗糖30g/L；以l/2 MS为基本培养基时，加蔗糖15g/L；以1/3 MS为基本培养基时，加蔗糖10g/L。培养基胨力强度为180g/cm2，pH值5.8~6.0。培养温度18~26℃，光照l0~12h/d。光照强度2000~3000lx。

3. 试验方法

（1）愈伤组织诱导培养 将无菌叶柄切成0.2cm左右的块接种到以MS为基本培养基，附加不同浓度的BA、NAA、IAA和2，4-D丁酯的培养基上，进行愈伤组织的诱导，60d后观察统计。

（2）愈伤组织及不定芽的分化培养 将在诱导菊苣叶柄形成愈伤组织的理想培养基上诱导出的叶柄颗粒状愈伤组织接种到附加不同浓度BA、NAA的l/2 MS+AgN03 20.5mg/L和l/3 MS+AgN03 20.5mg/L培养基上，进行愈伤组织的分化培养。

（3）不定芽生根培养 将上述分化培养的不定芽从基部剪下，接种到以1/2 MS和1/3 MS为基本培养基，附加不同浓度IAA、NAA和IBA的生根培养基上进行生根培养。培养到l0d时有的培养基上可见形成根原基。培养30d时观察统计。

（4）试管苗移栽 将生根苗培养瓶瓶塞打开，置于光照约5000Lx、温度20℃左右的条件下炼苗4d后，用镊子取出。洗去基部培养基，移栽到上面铺着5～6cm厚不同基质的温室苗床上。20d后观察统计。

二、结果与分析

1. 愈伤组织的诱导

在不用激素或BA与IAA配合使用条件下，不能诱导叶柄块形成愈伤组织；而浓度分别为0.4mg/L、0.8mg/L、1.2mg/L、1.6mg/L、2.0mg/L的BA与浓度为0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L和2.5mg/L的NAA、2,4-D丁酯配合使用时，几乎所有的叶柄块都能够诱导形成愈伤组织。

但诱导的愈伤组织生长速度及外部形态却差异较大。在BA浓度为0.4mg/L、2.4-D丁酯浓度为1.6mg/L的培养基上，不仅愈伤组织的诱导率为98%，愈伤组织的生长速度快，而且所诱导的愈伤组织外观呈淡绿色的颗粒状，愈伤组织颗粒问连接松散、质地疏松。一般认为，这种愈伤组织为具有分化能力的愈伤组织。

除MS+BA 0.4mg/L+2，4-D丁酯1.6mg/L这一培养基外，在其它培养基上诱导的愈伤组织从形态、结构、颜色和质地等性状上看.均为没有分化能力的愈伤组织或分化能力差的愈伤组织。

把在MS+BA 0.4mg/L+2,4-D丁酯1.6mg/L培养基上诱导的浅绿色颗粒状愈伤组织.在同一培养基上连续继代培养9代，形成的愈伤组织仍为具有分化能力的愈伤组织。这说明MS+BA0.4mg/L+2,4-D丁酯1.6mg/L是诱导菊苣叶柄形成具有分化能力愈伤组织的理想培养基。

2. 愈伤组织与不定芽的分化培养

培养结果表明：培养10d左右，有的愈伤组织颗粒形成了绿色的芽点；培养到40d时进行统计，只有部分培养基能诱导颗粒状愈伤组织分化。其中在l/2Ms+AgN03 20.5mg/L+BA 0.3mg/L+NAA 0.1mg/L培养基上不仅分化率达98.0%。

而且分化的不定芽为高1cm左右、长势较旺盛的丛生状。把分化形成的丛生芽从基部切下.接种到相同堵养基上进行分化不定芽分化继代培养45d后1个不定芽又会分化形成一丛生长较为旺盛的丛生不定芽。40d时平均分化增殖率为7.2倍。

经过连续11次的继代培养，其分化率和长势基本保持不变。由此说明，该研究中菊苣叶柄愈伤组织和不定芽分化的理想培养基为l/2Ms+AgN03 20.5mg/L+BA 0.3mg/L+NAA 0.1mg/L。