蟹味菇组织培养及分泌胞外酶研究

一、材料与方法

（一）材料

1. 菇体 新鲜蟹味菇子实体（上海浦东天厨菇业有限公司），购自学校附近利群超市。

2. 试剂 木聚糖；邻联甲苯胺，上海化学试剂总厂生产，分析纯；其他化学试剂，均为分析纯或化学纯。

3. 仪器 722E 型可见分光光度计（上海第三分析仪器厂），756MC 可见分光光度计（上海第三分析仪器厂，光学显微镜（上海第三分析仪器厂）。

4. 培养基

（1）综合马铃薯固体培养基（g/L ） 马铃薯 200，葡萄糖 20，KH2PO4 3 , MgSO4 1.5 , VB1 0.01 ，琼脂 20 。

（2）测木聚糖酶的液体培养基（g/L ） 马铃薯 200 ，麦麸 20 , KH2PO4 3 , MgSO4 1.5 , VB1 0.01 ， ( NH4 )2SO4 5 。

（3）测漆酶的液体培养基（g/L ） 马铃薯 200 ，麦麸 20 , KH2PO4 3 , MgSO4 1.5 , VB1 0.01 ，酵母膏 5 。

（二）方法

1. 分离菌种

（1）组织分离 组织分离是利用子实体组织来分离获得纯菌丝的方法，子实体实际上是菌丝体的扭结物，具有很强的再生能力，通过组织分离，可得纯菌种，此方法简便，取材广泛，不易发生变异，一般新鲜的菌体都能分离成功。组织分离时，选用菌盖肥厚、新鲜、无病虫害的子实体。

首先用70%的酒精棉球对菇体表面进行消毒，然后切取一小部分组织块，组织块尽量是菌盖和菌柄的交界处，其他地方如菌盖的周围部分、菌柄、菌柄中心都能萌发形成菌丝，但一般在菌柄与菌盖交界处的效果最好。

分别切取蟹味菇菌柄与菌盖处和菌盖边缘组织块在无菌条件下用70%酒精表面消毒1 min ，马上移人0.1%升汞溶液中消毒1-2 min ，用无菌水冲洗3 次，然后用灭过菌的剪刀将组织块剪成2 mm大小，接人试管斜面培养基上，置于25 ℃ 下恒温培养，并观察不同子实体接种部位组织分离污染情况。

（2）纯化 选取生长相对较好的组织分离所得母种的顶端菌丝体0.5cm2 左右接入试管斜面，进行纯化培养，每个处理重复5 次。25 ℃ 恒温培养，定时观察记录纯化菌丝体的萌发和生长情况。

（3）保存 将纯化后菌丝生长旺盛的斜面放入冰箱中，于-4 ℃ 保存，备用。

2. 培养方法与发酵液制备

（1） 培养方法 250ml三角瓶装液体培养基50ml ，灭菌后接人13 日龄用打孔器打成的10mm菌片4 片，130r /min , 28 ℃ 恒温振荡培养。

（2） 发酵液制备 在培养期间，每天取样，4000r /min 离心15min ，上清液即为发酵液。

3. 木聚糖酶活力测定

（1）底物1%和DNS试剂制备 木糖标准曲线制作均参照文献 。

（2）活力测定 取底物1ml于管中，据酶活大小加适量的粗酶液，补加柠檬酸钠缓冲液至2ml，50℃水浴反应30 min ，加3 ml DNS混匀，沸水浴7min ，取出冷却后加水至25 ml ，在540nm处测OD值。以每分钟1ml 粗酶液与木聚糖反应产生木糖的浓度作为1个酶活单位。

（3）漆酶活力测定 0.1mol /L PH值为4.6的醋酸缓冲液3.5min，加入3.36 mmol/ L 的邻联甲苯胺0.5 ml，再加入适当稀释的发酵液0.5min，25 ℃ 保温5 min , 756MC 型紫外可见分光光度计测595nm处光密度（OD 值），酶活力以样品与底物反应5 min 后光密度的改变值表示。以每分钟光密度增加0.001 为1个酶活力单位（U /ml）。

二、结果与分析

1. 分离蟹味菇组织分离成功率

蟹味菇较易进行组织培养，污染率小，可通过此方法获得优良菌株。

2. 纯化

蟹味菇子实体不同接种部位分离得到的菌丝纯化后在适宜的培养条件下均在15d 长满平板，10d 长满斜面，说明不同接种部位得到的菌丝基本不存在差异。菌丝体在PDA 斜面试管上呈浓白色，边缘为绒毛状，气生菌丝旺盛且爬壁能力强，成熟时色泽变灰。当培养条件不适时，生长速度减慢，菌丝可产生无性泡子。用光学显微镜观察，双核菌丝直径为2.0-3.0μm，细胞狭长，有明显锁状联合；单核菌丝直径为1.0-2.0μm，细胞狭长，有分隔，少分枝，无锁状联合。

3. 蟹味菇分泌木聚糖酶曲线

蟹味菇在液体培养基中进行深层培养，蟹味菇在前5d 产木聚糖酶水平不变，第6 天产木聚糖酶能力迅速上升，但第7 天产酶能力迅速下降，以后渐趋于平稳。

4. 蟹味菇对漆酶的分泌

蟹味菇在液体培养基中进行深层培养，漆酶的酶活力出现负值，在10d 的测定中有5d 是负值，第3 天的酶活力是零，基本可以判定蟹味菇不分泌漆酶，或者说它的分泌量很少，不易测得，基本不具有研究价值。

三、小结

蟹味菇是木生白腐菌的一种，有较强分解木质素、纤维素、半纤维素的能力；木聚糖酶和漆酶都是研究较多，且具有重要用途的酶，所以笔者选择他们做为研究对象。组织分离培养试验结果表明，纯化后的菌株生长力旺盛，可以为以后的科学研究保存菌株。液体发酵试验表明，蟹味菇分泌木聚糖酶，且产木聚糖酶能力较强，具有深人研究的价值，但一定程度上不分泌漆酶。对蟹味菇分泌木聚糖酶培养条件的优化将有待于进一步研究。