血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳

【 实验目的 】

1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。

2.熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作过程。

3.了解聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点和应用范围。

【实验原理】

1．聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理 聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺（Acrylamide简写为Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（N，N¹-methylene-bisacrylamide，简写Bis）在催化剂（过硫酸胺或核黄素）的作用下，聚合成含有酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两个链通过甲叉桥交联形成就具有三维网状结构的聚丙烯酰胺凝胶。为了加速聚合，在合成凝胶时还加入四甲基乙二胺作为加速剂。

聚丙烯酰胺凝胶具有三维网状结构，能起分子筛作用。用它作电泳支持物，对样品的分离不仅取决于各组分所带电荷的多少，也与分子大小有关。凝胶网孔的大小主要受成胶物的总浓度及Acr和Bis的比例的影响。一般电泳采用成胶物质总浓度为7.5%，此浓度称为标准凝胶浓度。如果改变总胶浓度，也应相应改变Acr和Bis的比例。

2．不连续聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳的原理 根据凝胶各部分缓冲液的种类及pH值，孔径大小是否相同等，可分为连续系统和不连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。连续系统是指电泳槽内缓冲液的pH值与凝胶中的相同，不连续系统则不同。

不连续圆盘电泳一般是在小玻璃管内进行的。把三种性质不完全一样的聚丙烯酰胺凝胶重叠起来。上层为样品胶，中间为浓缩胶，这两层胶的凝胶浓度为3%是大孔胶，应用Tris-HCl缓冲液，其pH6.7。

下层是分离胶，此层凝胶总浓度为7.5%，是小孔胶，也用Tris-HCl缓冲液，pH8.9。上下电泳槽缓冲液是Tris-甘氨酸缓冲液，pH=8.3。由于凝胶的孔径和缓冲液的pH值不同，产生浓缩效应、电荷效应和分子筛效应，使电泳的灵敏度、分辨率提高。

（1）浓缩效应：无论哪种电泳方式，要想得到良好的分离效果，电泳开始前必须使样品中各种成分同处于同一起跑线上。样品加入后颗粒分散，不能从同一起点开始电泳，但样品通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层，使颗粒同时开始电泳。

其机理是样品胶及浓缩胶的Tris-HCl缓冲液pH=6.7，电泳时，HCl全部电离为Cl - ，而电泳槽内Tris-甘氨酸缓冲液pH=8.3，甘氨酸等电点pI=6.0，电泳时，甘氨酸仅极少部分电离为甘氨酸负离子（Gly - ），一般血清蛋白质点约pI=5.0，也解离为蛋白质负离子（Pr - ），其解离度比HCl小，比甘氨酸大。

通电后，这三种离子同时向正极泳动，有效泳动率是Cl - ＞Pr - ＞Gly - ，电泳时开始时，Cl - 泳动最快（称快离子），很快超过Pr - ，泳动到最前面，Gly - 泳动最慢（称慢离子），泳动到最后，Pr - 介于其间，被浓缩成一个狭小的样品薄层。

这种浓缩作用可使蛋白质浓缩数百倍。血清蛋白在纸上电泳和醋酸纤维素薄膜电泳上仅可分成5～7个组分。而在聚丙烯酰胺凝胶电泳上则可以分为20～30个成分。

（2）电荷效应：蛋白质样品在界面处被浓缩成一狭窄的样品薄层，进入分离胶。由于各种蛋白质分子的等电点不同，在同一pH的缓冲液中所带有效电荷不同，因而泳动率也不同，因此各种蛋白质就按泳动率快慢顺序排列成一个一个圆盘状的蛋白质区带。

（3）分子筛效应：各种蛋白质分子由于分子大小和构象不同，因而通过一定孔径的分离胶时所受的摩擦力不同，受阻滞的程度不同，表现的泳动率的不同而被分开。即使蛋白质所带的净电荷相似，也会由于分子筛效应被分开。

【器材和试剂 】

1． 器材 电泳仪、圆盘电泳槽、微量加样器、注射器、50ml小烧杯

2． 试剂

（1）30%丙烯酰胺储存液：丙烯酰胺 30.0g/>，甲叉双丙烯酰胺 0.8g/>，加水至100ml，棕色瓶 4℃/>保存。

（2）催化剂（10％过硫酸铵）：过硫酸铵 1g/> 加水至10ml，临用前现配。

（3）加速剂：四甲基乙二胺 (TEMED）

（4）分离胶缓冲液（pH8.8）：取三羟甲基氨基甲烷（Tris ） 36.3g/>，加入1 mol /L HCl 48ml ，再加蒸馏水至100ml， 4℃/>保存。

（5）浓缩胶缓冲液（pH6.8）：取 6.0g/> Tris，用1 mol /L HCl 48 ml，再加蒸馏水至1000ml， 4℃/>保存。

（6）电泳缓冲液（pH8.3）：取 28.8g/>甘氨酸， 6.0g/> Tris，分别溶解后，加蒸馏水到100ml ， 4℃/>保存。

(7)染色液：考马斯亮蓝R-250 0.46g/>、甲醇（可用无水乙醇代替）110ml、28ml冰乙酸，TritonX-100 1ml,溶解后补足水至总体积400ml。

（8）脱色液（30%甲醇、7%乙酸）：甲醇（可用无水乙醇代替）110ml，冰乙酸28ml，TritonX-100 8ml,补足水至400ml。

（9）保存液 : 7%冰醋酸。

（10）样品稀释液：浓缩胶缓冲液25 ml加入蔗糖 10g/>及0.05％溴酚蓝5ml，最后加水至100ml。

【操作步骤】

1．凝胶柱的制备

（1）取两端已有金钢砂磨平的 10cm/>× 0.6cm/> 的玻璃管。在距一端 7cm/>和 7.5cm/>处，各划一条线。插入橡皮垫中，垂直安放于 试管 架中。

（2）按下表配制分离胶，迅速用滴管将其沿管壁加入玻璃管内，至 7 cm/>画线处。

	分离胶(ml)	浓缩胶(ml)
30%丙烯酰胺	2.50	1.00
分离胶缓冲液(pH8.8)	1.25	—
浓缩胶缓冲液(pH6.8)	—	1.25
蒸馏水	6.20	7.65
TEMED	0.05	0.05
10%过硫酸铵	0.05	0.05
总体积	10	10
丙烯酰胺浓度（g%）	7.5	3.0

（3）随即用5ml注射器经针头沿玻璃管壁加入蒸馏水约 0.5cm/>高度，加水时要缓慢，尽量减少凝胶表面的震动与混合。静置，待凝胶聚合后(约20min)，去除水相，然后用吸水纸吸干残余的液体。

（4）按上表配制浓缩胶，立即用滴管沿凝胶管壁加至 7.5cm/>处，并随即沿管壁缓慢加入蒸馏水约 0.5cm/>高度，静置20分钟。

2．样品配制 正常入血清0.3ml，加入样品稀释液1.7ml，轻摇混匀。

3．电泳

（1）将上述制备好的凝胶管分别插入上电泳槽的橡胶塞孔中，高出槽底。

（2）下电泳槽加入10倍稀释的电泳缓冲液，随后放入带凝胶管的上电泳槽。

（3）加样：用微量注射器取样品液加30μl ，沿管壁慢慢加在浓缩胶面上，再用缓冲液沿管壁缓慢加在样品液上（防止与样品液混合稀释），直到加满玻璃管，在电泳槽先加入少量缓冲液，检查一下是否漏水，如不漏水，加入适量缓冲液，然后将带电极的盖放好。

（4）电冰：将上层电极糟的电极接在电泳仪的负极、下层电极糟的电极接在电泳仪的正极、接好电源。调节电流为lmA /管。待示踪剂进入分离胶时，调节电流为3mA/管。当示踪剂移至距玻璃管下口时，停止电泳。

4．剥胶 取下凝胶管，用带有 10cm/> 长针头的注射器，内装蒸馏水做润滑剂，沿管壁插入管内，边注入水边旋转玻璃管。直至胶柱与管壁分开。然后用吸耳球轻轻在胶管的一端加压，使凝胶从玻璃管中缓慢滑出。

5．固定 将胶柱移入12.5%的三氯乙酸溶液中，固定10min。向装有凝胶柱的 试管 中加入染色液，

6.染色与脱色 将固定后的凝胶柱移入染色液， 60℃/> 水浴 中染色10～20min，随后移入脱色液中， 60℃/>脱色30～60min。

7.保存 将脱色后的凝胶柱移入7%冰乙酸溶液中，密封保存，观察结果, 记录 血清 蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳可分多少区带。

【注意事项】

1．Acr和Bis都是神经性毒剂，对皮肤有刺激作用、但在形成凝胶后则无毒，操作时应尽量避免接触皮肤，并注意洗手。

2．蛋白加样量要合适。加样量太少，条带不清晰；加样量太多则泳道超载，条带过宽而重叠，甚至覆盖至相邻泳道。

3．过硫酸铵的主要作用是提供自由基引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合反应，故一定要新鲜，贮存过久的过硫酸铵商品不能使用。此外，10%过硫酸铵必须现用现配， 4℃/>冰箱贮存不超过48h。

4.灌制凝胶时，应避免产生汽泡，因为汽泡会影响电泳分离效果。

5.刚灌注分离胶混合溶液后，应在分离胶液面上加1～ 2cm/>高的水层，以阻隔空气。胶液面上加水层时要特别小心，缓缓叠加，以免冲坏凝胶的胶面。

【思考题】

1．电泳时，为什么要把上层电泳槽接在负极上？

2. 使聚丙烯酰胺凝胶具有高分辨率的三个因素是什么?